商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較

李小玲，華智銳

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥工程系，陜西商洛 726000）

商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較

李小玲，華智銳

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥工程系，陜西商洛 726000）

為探討野生蕙蘭基因組DNA最佳提取方法，本研究以商洛野生蕙蘭幼嫩葉片為材料，采用SDS、CTAB、高鹽CTAB法提取商洛野生蕙蘭的基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取DNA進(jìn)行完整性檢測(cè)，用紫外分光光度法對(duì)DNA進(jìn)行純度、濃度和提取率檢測(cè)。結(jié)果表明，3種方法所提DNA的濃度分別為2 223，2 980和3 371μg·mL-1，提取率分別為222.3，298.0和337.1μg·g-1，D260／D280分別為1.583，1.672和1.967，高鹽CTAB所提取DNA的D260／D280比值1.8～2.0，濃度、純度及提取率均最高，電泳條帶清晰，由此初步確定3種方法中高鹽CTAB法為商洛野生蕙蘭基因組DNA最佳提取方法。

野生蕙蘭；基因組DNA；提取方法；比較

蕙蘭（Cymbidium faberi）為蘭科蘭屬的地生草本植物。蕙蘭是我國珍稀物種，為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生物種。蕙蘭原分布于秦嶺以南、南嶺以北及西南廣大地區(qū)，是比較耐寒的蘭花品種之一。在秦巴山區(qū)不少地方均有分布，商洛一帶蘭花的分布也很廣泛，其中就有蕙蘭。

DNA是分子研究的基礎(chǔ)物質(zhì)，其提取技術(shù)則成為分子生物學(xué)的基本技術(shù)［1］。DNA的濃度，尤其是DNA的純度嚴(yán)重影響后續(xù)基因組酶切等結(jié)果［2］。由于蕙蘭花朵中的酚類、多糖類物質(zhì)含量較高，所以從葉片中提取出高質(zhì)量的DNA樣本有一定的難度，其提取方法的確定及優(yōu)化需要不斷摸索。本研究選取SDS法［3］、CTAB法［4］、高鹽CTAB法［5-6］3種DNA提取方法，旨在通過對(duì)商洛野生蕙蘭葉片基因組DNA提取效果進(jìn)行比較，探討適合蕙蘭基因組DNA的提取方法，為蘭花分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料預(yù)處理

野外采集商洛野生蕙蘭幼嫩葉片，蒸餾水洗去塵土，晾干，放入-20℃冰箱預(yù)冷備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：人工氣候箱、超低溫冰箱、制冰機(jī)、紫外分光光度計(jì)、電子天平、高壓滅菌鍋、超純水儀、移液器、核酸電泳儀、恒溫水浴鍋、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。

主要試劑：SDS（十二烷基磺酸鈉）、CTAB（十二烷基溴化氨）、EDTA（乙二胺四乙酸）、氯化鈉、β?巰基乙醇、氯仿／異戊醇、異丙醇、RNase A、Tris?HCl、醋酸鉀、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、Marker DL2000、蔗糖、硼酸、無水乙醇等。

1.3 溶液配制

1.3.1 1 mol·L-1Tris?HCl溶液（pH值8.0）

將12.11 g Tris堿溶于80 mL超純水中，待溶液冷卻至室溫后，用濃鹽酸調(diào)定pH值至8.0，定容至100 m L后，分裝、高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 0.5 mol·L-1EDTA溶液（pH值8.0）

將18.61 g EDTA?Na2·H2O溶于80 mL超純水中，用固體氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 5 mol·L-1NaCl溶液

將29.22 gNaCl溶于80 mL超純水中，定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 50%PVP溶液

25 g PVP（相對(duì)分子質(zhì)量10 000）溶于80 mL超純水中，定容至100 mL，高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 10×CTAB抽提液

將14 mL 5 mol·L-1NaCl與66 mL超純水混合，在加熱和攪拌下緩慢加入10 g CTAB。可加熱至65℃，使之溶解，定容至100 mL，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 3 mol·L-1乙酸鈉溶液（pH值5.2）

40 mL去離子水中加40.81 g三水合乙酸鈉，用冰醋酸調(diào)pH值至5.2，再加稀醋酸定容100 mL，高溫滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 10 g·L-1RNase A溶液

取RNase A 100 mg、1 mol·L-1Tris?HCl（pH值7.5）0.1 m L、5 mol·L-1NaCl2.8 mL、超純水7.0mL混合，攪拌使RNase A充分溶解，100℃加熱15 min，冷卻至室溫后定容至10 mL，10 000 r·min-1離心15min，取上清液分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 10%SDS溶液

將10 g SDS溶于80 mL超純水中，定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 SDS提取緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

將1 mol·L-1Tris?HCL（pH值8.0）10 mL、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）10 mL、5 mol· L-1NaCl10 mL、10%SDS 20 mL、50%PVP 5 mL、100%β?巰基乙醇1 m L、超純水44 mL混勻備用（100 mL）。

1.3.10 2×CTAB提取緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

將1 mol·L-1Tris?HC1（pH值8.0）10 m L、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）4 mL、5 mol· L-1NaCl28 mL、50%PVP10 mL、10×CTAB抽提液20 mL、100%β?巰基乙醇2 mL、超純水26 mL混勻備用（100 mL）。

1.3.11 高鹽2×CTAB提取緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）

將1 mol·L-1Tris?HCl（pH值8.0）10 m L、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）4 mL、5 mol· L-1NaCl 40 m L、50%PVP 10 m L、10×CTAB抽提液20 mL、100%β?巰基乙醇2 mL、超純水14 mL混勻備用（100 mL）。

1.3.12 TE緩沖液（pH值8.0）

將1 mol·L-1Tris?HCl（pH值8.0）2.0 m L、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）0.4 mL、超純水197.6 m L混合，調(diào)溶液pH值至8.0，分裝后高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆茫?00 m L）。

1.3.13 5×TBE（Tris?硼酸）電泳緩沖液

稱27 g Tris堿，13.75 g硼酸，加入0.5 mol· L-1EDTA（pH值8.0）10 mL，蒸餾水350 mL，攪拌溶解后，定容至500 mL。瓊脂糖凝膠電泳時(shí)使用液為0.5×TBE，取配制的5×TBE 500 mL加水定容至5 L即可。

1.4 DNA提取方法

1.4.1 SDS法

稱取0.2 g樣本用液氮研磨成粉，加入lmL提取液（500 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris?HCl pH值8.0，50 mmol·L-1EDTA，2%β?巰基乙醇）室溫?cái)?shù)分鐘解凍后，加入0.5 mL10%SDS溶液，輕輕混勻，于65℃保溫30 min；取出后立即置于冰上，加0.24 mL 5 mol·L-1KAc溶液于冰上反應(yīng)30 min；10 000 r·min-1，4℃離心20 min；取上清液加1倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min；10 000 r·min-1，4℃離心20 min；用0.5 mL TE緩沖液溶解沉淀，加等體積的氯仿?異戊醇（24∶1），混勻；10 000 r·min-1，4℃離心10 min；取上清液加0.8倍體積-20℃預(yù)冷的異丙醇和1／10體積的3 mol·L-1NaCl，-20℃靜置30 min沉淀DNA；10 000 r·min-1，4℃離心20 min；70%的乙醇洗滌DNA沉淀2次，風(fēng)干后溶于100μL TE緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 傳統(tǒng)CTAB法

取0.2 g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干；植物材料剪成1 cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研缽中。加入液氮速冷，研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）；在5 mL離心管中加入抽提緩沖液1 m L，65℃保溫1 h；15 000 r·min-1，離心10 min；上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中；加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀；15 000 r·min-1，離心10 min；上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中；加入1倍體積預(yù)冷無水乙醇，-20℃保溫30～60 min，緩緩混勻DNA成絮狀析出；15 000 r·min-1，離心10 min，棄上清；DNA沉淀用70%乙醇洗2次；加入100μL TE buffer溶解DNA。

1.4.3 高鹽CTAB法

取0.2 g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干；植物材料剪成1 cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研缽中；加入液氮速冷，研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）；在5 mL離心管中加入抽提緩沖液1 mL，65℃保溫1 h；15 000 r·min-1，離心10 min。上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中∶加入等體積氯仿：異戊醇（24∶1），混勻抽提至水乳膠融狀；15 000 r·min-1，離心10 min；上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中；加入1倍體積預(yù)冷無水乙醇，-20℃保溫30～60 min，緩緩混勻DNA成絮狀析出；15 000 r·min-1，離心10 min，棄上清；DNA沉淀用70%乙醇洗2次；加入100μL TE buffer溶解DNA。

1.5 DNA提取質(zhì)量的檢測(cè)

1.5.1 瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)

將不同方法提取所得的DNA溶液各取5μL，與1μL載樣緩沖液（LB）混勻后，在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE液，電壓為80 V。待混合液藍(lán)色條帶遷移適當(dāng)距離（一般為距加樣孔3～5 cm處）時(shí)停止電泳，取出凝膠，將凝膠小心放入事先配好的EB溶液（濃度為0.5μg·mL-1）中浸泡染色30～50 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相［2］。

1.5.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)3種方法對(duì)商洛野生蕙蘭葉片基因組DNA的吸光度（D）的測(cè)定，并分析其濃度和純度。TE緩沖液作為空白對(duì)照，按儀器的使用說明進(jìn)行操作，D值為5次測(cè)量后的平均值。

根據(jù)D260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50μg· mL-1，DNA濃度／（μg·mL-1）＝D260×50μg· m L-1×稀釋倍數(shù)。根據(jù)D260／D280比值評(píng)價(jià)核酸純度，當(dāng)D260／D280數(shù)值大于2.0時(shí)，表示有RNA的污染；數(shù)值小于1.8時(shí)，表示有蛋白質(zhì)污染；數(shù)值為1.8～2.0時(shí)，表示提取的DNA的純度較高。DNA提取率提取率／（μg·g-1）＝DNA濃度×體積／樣重。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種方法所提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

采用SDS、CTAB和高鹽CTAB法提取商洛野生蕙蘭基因組DNA，并進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳后的凝膠成像圖譜（圖1）。

圖1 不同方法提取DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

從3種方法所提取DNA跑出條帶分析，均出現(xiàn)了圖譜模糊亮帶及拖尾現(xiàn)象。所以，3種方法所提取基因組DNA完整性較差，通過電泳圖譜很難判斷提取效果優(yōu)劣。幾種方法所得電泳條帶均有拖尾現(xiàn)象，原因可能是DNA提取所用材料在儲(chǔ)存和操作過程中產(chǎn)生了組織DNA的部分降解。

2.2 3種方法所提DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

對(duì)3種方法所提DNA分別進(jìn)行吸光度檢測(cè)（表1），采用SDS、CTAB和高鹽CTAB法測(cè)得D260／D280比值分別為1.583，1.672，1.967。其中高鹽CTAB法提取的DNA純度最高，而SDS和CTAB法的比值均小于1.8，說明有一定的蛋白質(zhì)污染。

表1 不同方法所提DNA紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

從表中可以看出，高鹽CTAB法提取到DNA濃度和提取率最高，其次為CTAB法，SDS法最小，依次初步判定這3種方法提取的DNA效果為，高鹽CTAB法最佳，CTAB法次之，SDS法相對(duì)較差。

3 小結(jié)與討論

以商洛野生蕙蘭幼嫩葉片為材料，通過SDS、CTAB和高鹽CTAB法提取基因組DNA。高鹽CTAB法獲得DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好，但方法還有待完善。

PVP是一種酚的絡(luò)合物，同時(shí)含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)，較易溶解于極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，可有效去除酚類物質(zhì)。本研究在提取緩沖液中加入適量的PVP，有效去除了產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)。

基因組DNA的降解對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響，降解的原因有很多，如外界物理因素（溫度、濕度）、化學(xué)因素（pH值、水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)）和生物因素（酶解及微生物侵染）等。推測(cè)基因組DNA不同程度的降解，可能由于蕙蘭葉片老化且木質(zhì)化程度較高而導(dǎo)致組織研磨困難或操作時(shí)間過長造成。為得到盡可能完整的基因組DNA，在今后研究中應(yīng)盡量簡(jiǎn)化操作步驟；提取過程應(yīng)溫和操作，避免劇烈震蕩，用剪去尖端的槍頭吸取上清液，吸取過程避免產(chǎn)生氣泡，不要反復(fù)吸打助溶DNA；干燥DNA沉淀時(shí)，應(yīng)注意沉淀的干燥程度，太干會(huì)導(dǎo)致沉淀不易重懸。另外，提取植物基因組DNA時(shí)要用氯仿?異戊醇抽提幾次，抽提次數(shù)不夠會(huì)導(dǎo)致蛋白等雜質(zhì)過多，但抽提次數(shù)過多則會(huì)丟失部分DNA。對(duì)于蕙蘭基因組DNA提取方法的具體優(yōu)化還有待研究。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 682.31 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

A

0528?9017（2014）01?0073?03

文獻(xiàn)著錄格式：李小玲，華智銳.商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：73-76.

2013?08?19

李小玲（1980-），女，陜西藍(lán)田人，講師，碩士，主要從事植物生物技術(shù)研究工作。E?mail：huazhirui2080＠21cn.com。