產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶黑木耳菌株的篩選及酶活力的測(cè)定

于德涵,黎 莉,蘇 適

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,黑龍江綏化 152000）

產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶黑木耳菌株的篩選及酶活力的測(cè)定

于德涵,黎 莉,蘇 適

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,黑龍江綏化 152000）

為獲得產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的黑木耳菌株,從野外采集的37株黑木耳菌株中篩選產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶單株,最終得到2株目標(biāo)菌株,并測(cè)定其產(chǎn)酶活力,2株黑木耳分泌Lip最高酶活力分別為0.021和0.035U·mL-1。

黑木耳；木質(zhì)素過(guò)氧化物酶；篩選；酶活測(cè)定

木質(zhì)素降解酶包括漆酶（Lac）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lip）,是微生物降解木質(zhì)素的最主要也是最有效的酶類［1］。Lip分子內(nèi)含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶,具有較差的底物專一性,可和苯酚、芳香胺、芳香醚、多環(huán)芳香化合物等多種不同的木質(zhì)素模型化合物反應(yīng),對(duì)木質(zhì)素廣泛的分解特性使Lip在木質(zhì)素的降解過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。木質(zhì)素降解酶是微生物分解植物纖維木質(zhì)素的重要酶類,有證據(jù)顯示,多種食用菌胞外酶活力尤其是木質(zhì)素降解酶的活力與其栽培產(chǎn)量呈正相關(guān)［2］。黑木耳（A.auricula-judae）的木質(zhì)素降解酶體系中僅包括2種Lac和MnP,而僅有少量品種或菌株有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶產(chǎn)生［3-4］。因此,尋找或培育產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的黑木耳優(yōu)良菌株,一方面有利于人們進(jìn)一步了解該酶的特性,并為提高人工栽培黑木耳篩選優(yōu)良菌種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；另一方面更有利于黑木耳對(duì)秸稈、稻草等木屑替代栽培物的降解,提高秸稈、稻草等農(nóng)田廢棄物的利用率,降低代料栽培黑木耳的成本,減少對(duì)森林資源的浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為野生黑木耳菌種TH1～TH37,共37株,均采自黑龍江省伊春桃山林業(yè)局。

試劑有天青B（AzureB,美國(guó)Sigma公司）,其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器有752型紫外分光光度計(jì)、BILON-HW-10型恒溫水浴鍋、SIGMA2-16PK冷凍高速離心機(jī)、CLG-32L立式全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器、PHS-3C型數(shù)顯pH計(jì)、DNP-9022-1型恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 培養(yǎng)基的配制

PDA固體培養(yǎng)基。馬鈴薯洗凈、去皮、切成小塊,稱取200g,加1L蒸餾水,大火煮至沸騰后,改文火煮30min,八層紗布過(guò)濾,向?yàn)V液中加入20g葡萄糖,2.0gKH2PO4,1.0gMgSO4,15g瓊脂,充分?jǐn)噭蚝蠖ㄈ葜?000mL［5］。

PDA液體培養(yǎng)基Ⅰ。配方與配制方法同去除瓊脂的PDA固體培養(yǎng)基。

PDA液體培養(yǎng)基Ⅱ。在PDA液體培養(yǎng)基I的基礎(chǔ)上,每1000mL培養(yǎng)基添加100g木屑。

檢測(cè)培養(yǎng)基。稱取酵母浸出物10.0g,葡萄糖10.0g,瓊脂20.0g,加蒸餾水600mL,加熱使其充分溶解,再加亮藍(lán)6.25g,用蒸餾水定容至1000mL。

所有培養(yǎng)基配制后,于0.1MPa、121℃滅菌20min,備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將保藏菌株接入PDA斜面培養(yǎng)基,于28℃培養(yǎng)4d后轉(zhuǎn)接1次,再于28℃培養(yǎng)7d,將其轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d,待用。

1.3.2 過(guò)氧化物酶的檢測(cè)

在活化的菌種平板培養(yǎng)基和含亮藍(lán)的培養(yǎng)基上分別打直徑3mm的小孔,將含菌絲的菌塞接種于亮藍(lán)培養(yǎng)基的小孔內(nèi),每個(gè)菌種3次,置28℃恒溫培養(yǎng),每隔24h觀察亮藍(lán)平板中接種菌落周圍是否出現(xiàn)變色圈,以有無(wú)變色圈的出現(xiàn)判斷是否有過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生,有變色圈者記為“+”,反之則為“-”,并記錄顯色時(shí)間［6］。有變色圈出現(xiàn)的菌種分別在第7天測(cè)量菌絲圈（d1）和變色圈的直徑（d2）。

1.3.3 粗酶液的制備

在經(jīng)活化且有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶檢出的菌種平板上,挑取適量菌絲分別接種于含250mLPDA液體培養(yǎng)基I和II的250mL三角瓶中,28℃靜置培養(yǎng)1d后,于28℃、130r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)20d,第3天起,每天從培養(yǎng)液中吸取10mL發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)保存。所有發(fā)酵液于3000r·min-1離心15min,上清液即粗酶液I和II,保存于冰箱中備用。

1.3.4 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的檢測(cè)

選取上述有變色圈出現(xiàn)的粗酶液I（培養(yǎng)7d）,于無(wú)菌條件下取3.5mL粗酶液,0.3mL 0.5mol·L-1的酒石酸鉀鈉緩沖液（pH值4.0）, 0.1mL1mmol·L-1的亞甲基藍(lán)溶液混合,再向體系中加入0.1mL4.5mmol·L-1的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。以滅活的粗酶液I（7d）反應(yīng)體系作空白對(duì)照,若反應(yīng)體系由淡藍(lán)綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色,則表明有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶產(chǎn)生,否則無(wú)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶產(chǎn)生［7］。有顏色變化者用“+”標(biāo)記,無(wú)顏色變化者用“-”標(biāo)記。

1.3.5 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活力測(cè)定

對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的粗酶液樣本進(jìn)行酶活測(cè)定。在試管中加入2mL濃度為0.125mol·L-1的檸檬酸緩沖液（pH值為3.0）、1mL濃度為0.16mmol·L-1的天青B溶液、1mL粗酶液I, 30℃恒溫水浴中保存5min后,向試管中再加入30℃2mmol·L-1H2O2溶液1mL啟動(dòng)反應(yīng),精確計(jì)時(shí)。測(cè)量反應(yīng)在最初3min內(nèi)在651nm處的吸光度（D）的減小速率,以每分鐘每毫升粗酶液降低0.1個(gè)D值為1個(gè)酶活力單位［8-9］。每待測(cè)樣品平行操作3次,取平均值。以相同的方法檢測(cè)粗酶液Ⅱ中Lip酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化物酶的檢測(cè)

在含亮藍(lán)的PDA平板培養(yǎng)基上接種3mm的菌絲,28℃下培養(yǎng),每24h觀察1次。結(jié)果（表1）17個(gè)菌株有15個(gè)樣本培養(yǎng)基中出現(xiàn)變色圈。

表1 變色圈產(chǎn)生及菌絲圈和變色圈直徑變化

2.2 Lip檢測(cè)

將除TH4和TH33外的產(chǎn)生變色圈的菌株進(jìn)行Lip檢測(cè),反應(yīng)體系變色情況如表2所示。

表2 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶檢測(cè)結(jié)果

2.3 Lip活力測(cè)定

利用天青B染料對(duì)分泌Lip的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定。不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液濾液中Lip活力結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株不同培養(yǎng)時(shí)間的Lip活力變化

3 討論與小結(jié)

3.1 過(guò)氧化物酶的檢測(cè)

現(xiàn)階段,常用一些特定的顏色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)一個(gè)菌株是否具有降解木質(zhì)素的能力,微生物若是能產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶尤其是過(guò)氧化物酶類,就能和培養(yǎng)基中的有效指示劑反應(yīng),產(chǎn)生特異的顏色變色圈,亮藍(lán)是檢測(cè)過(guò)氧化物酶的常用指示劑。在PDA培養(yǎng)基中添加適量亮藍(lán),在接種部位有過(guò)氧化物酶產(chǎn)生則會(huì)在其周圍形成黃色的顯色圈,并且酶活力的強(qiáng)弱和黃色圈的大小正相關(guān)。變色圈的形成有兩種方式,一種是變色圈位于菌絲圈的內(nèi)部,即d1＞d2（d1是菌絲圈直徑,d2是變色圈直徑）,另一種是變色圈在菌絲圈外部,即d1＜d2,二者是由于不同菌株間菌絲生長(zhǎng)速度差異和分泌過(guò)氧化物酶能力的差異造成的［10］。

有研究表明,變色圈的實(shí)際面積的大小反映了酶對(duì)木質(zhì)素降解能力的強(qiáng)弱,因此d2/d1可作為判定該微生物是否降解木質(zhì)素的依據(jù),如比值大于1,纖維素首先被降解；若比值小于1,則該微生物會(huì)首先選擇性地降解木質(zhì)素,且比值越小,越說(shuō)明單位菌株可能產(chǎn)生酶的能力及酶活力越強(qiáng)［11］。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,待檢的37株菌株中有35株都有變色圈產(chǎn)生,而在第7天在對(duì)產(chǎn)生變色圈的菌落分別測(cè)定菌絲圈和變色圈,并計(jì)算二者比值的結(jié)果顯示,35株有過(guò)氧化物酶產(chǎn)生的菌株中,其d2/d1的值全部小于1,初步判斷應(yīng)會(huì)優(yōu)先降解木質(zhì)素。試驗(yàn)中,菌株TH6的d2/d1最小為0.062,表明該菌株可能降解木質(zhì)素的能力最強(qiáng)。利用指示劑的變色圈反應(yīng),只是對(duì)氧化物酶的一種定性檢測(cè)方法,而具體的酶活力須經(jīng)過(guò)定量檢測(cè)才能確定。

3.2 Lip的檢測(cè)

亞甲基藍(lán)是木質(zhì)素降解酶的定性檢測(cè)指示劑,在有過(guò)氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)的條件下,分泌Lip的菌株會(huì)使亞甲基藍(lán)溶液的顏色由藍(lán)綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色。將初步判斷有過(guò)氧化物酶產(chǎn)生的菌株進(jìn)行Lip檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明,35株菌株中僅有2株菌株（TH11和TH20）有Lip產(chǎn)生,其余菌株分泌的過(guò)氧化物酶成分可能為Mnp或其他。

3.3 Lip活力測(cè)定

現(xiàn)階段,對(duì)測(cè)定Lip活力的底物常用藜蘆醇（Veratrylalcohol,VA）或天青染料。在采用藜蘆醇作底物時(shí),要使用pH為2.5的緩沖液,酶在此pH條件下容易失活,且該檢測(cè)方法還對(duì)溫度的穩(wěn)定性有很高的要求,尤其是該法的檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm,微生物代謝產(chǎn)生的酚和苯類物質(zhì)都會(huì)對(duì)紫外的吸收產(chǎn)生影響［12-13］。測(cè)定Lip的天青多為天青B,其穩(wěn)定性高,生物反應(yīng)條件下不易被脫色,專一性好,和Lac及MnP都不起反應(yīng)；另外,該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為651nm,為可見(jiàn)光區(qū),能夠避免芳香化合物對(duì)檢測(cè)的干擾,從而提高檢測(cè)的靈敏度［14-15］。研究表明,一般在液體發(fā)酵第3天開(kāi)始,陸續(xù)有胞外酶分泌,培養(yǎng)7～9d酶活力基本能達(dá)到峰值［16］,故試驗(yàn)在液體培養(yǎng)第3天開(kāi)始進(jìn)行活力測(cè)定,連續(xù)測(cè)定20d。測(cè)定結(jié)果顯示,菌株TH11在第7天活力達(dá)到0.021U·mL-1,隨后酶活力陡降；菌株TH20酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而快速升高,第8天最高,達(dá)到0.035U·mL-1,隨后也快速下降至接近無(wú)活性。而在培養(yǎng)基中添加木屑作為L(zhǎng)ip的底物后,2個(gè)菌株達(dá)到最大酶活力的培養(yǎng)天數(shù)仍然是8d左右,但最大酶活力增加了3倍,分別達(dá)到0.057和0.096U·mL-1,且因?yàn)橛械孜锏拇嬖?酶活力在達(dá)到峰值后會(huì)在峰值保持2～3 d,而后因底物減少而緩慢下降,二者在培養(yǎng)20d后,仍有較低的酶活性。

試驗(yàn)對(duì)37株野生黑木耳菌株進(jìn)行篩選,從中得到2株分泌Lip的菌株,其酶活力分別為0.021和0.035U·mL-1,活力水平較低,但為后續(xù)培育產(chǎn)高效及高活力Lip菌種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

Q554.9

B

0528-9017（2014）02-0204-04

文獻(xiàn)著錄格式：于德涵,黎莉,蘇適.產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶黑木耳菌株的篩選及酶活力的測(cè)定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（2）：204-207.

2013-10-22

綏化學(xué)院科研項(xiàng)目（KQ1202008）

于德涵（1982-）,男,黑龍江綏化人,講師,碩士,從事食用菌胞外酶及分子生物學(xué)的研究工作。E-mail：Yudehan @163.com。