2種豆類植物病原細菌的紅外光譜檢測與鑒定

徐曉鷗,吳志毅,陳 曦,王有杰,夏 拯

（1.浙江大學,浙江杭州 310058；2.浙江出入境檢驗檢疫局,浙江杭州 310016）

2種豆類植物病原細菌的紅外光譜檢測與鑒定

徐曉鷗1,2,吳志毅1,2,陳 曦2,王有杰2,夏 拯2

（1.浙江大學,浙江杭州 310058；2.浙江出入境檢驗檢疫局,浙江杭州 310016）

菜豆細菌性暈疫病與豌豆細菌性疫病是由丁香假單胞桿菌屬（Pseudomonassp.）細菌引起的2種重要豆科作物細菌性病害。傳統檢測方法不僅周期長,且鑒定步驟繁瑣。本研究首次使用紅外光譜技術進行檢測和鑒定,發現2種病原菌在3000～4000cm-1內具有特異性峰位,顯示該方法可行。

菜豆暈疫病；豌豆細菌性疫病；紅外光譜技術

菜豆暈疫病是豆科作物一種重要的檢疫性細菌病害［1-2］,可侵染扁豆,赤豆,木豆,桑橙,多花菜豆,月豆,菜豆,碗豆,葛,野葛,綠豆,豇豆和大豆。盡管很多國家采取了一系列的防御措施,該病害仍以驚人的速度傳播和蔓延,至今已在世界各大洲的60多個國家和地區有分布。我國黑龍江地區也有該病害發生的記錄。菜豆暈疫病主要通過帶菌種子作遠距離傳播,在田間則通過風雨、灌溉傳播。發病時主要侵染葉片,初在葉片或新生葉上現不規則水浸狀斑點,后在斑周圍出現直徑0.5～1.0cm的暈圈,斑上常有菌膿溢出；葉脈染病致葉脈壞死,易穿孔或皺縮畸形；果莢染病初現水浸狀斑點,后變褐干縮下陷,斑面滲出菌膿,或病斑中央枯死點小。

豌豆細菌性疫病與菜豆暈疫病一樣,同是丁香假單胞桿菌屬（Pseudomonassp.）細菌引起的一種重要豆科作物的細菌性病害［3-5］,其主要寄主有豌豆、扁豆、香豌豆、野豌豆。該病目前在歐洲、亞洲、美洲、大洋洲均有發生,但在我國還未見報道。豌豆細菌性疫病主要以帶菌種子進行遠距離傳播,病菌在種子表面或種子內部至少可存活10個月,潛在傳入危險性較大。所有地上部分的組織受害后表現為壞死斑,其中在莖稈和托葉上的癥狀最明顯。系統侵染可能導致整個植株萎蔫枯死,侵染花梗可引起花和豆莢枯萎,導致植株猝倒,早期侵染可造成嚴重損失,對產量影響較大。

2012年,我國進口大豆5838萬t,較2011年增長了10.9%。隨著大豆進口量的日益增加,大豆病害進入我國的風險也隨之增加。紅外光譜檢測技術是一種利用物體受到頻率連續變化的紅外光照射時,分子吸收了某些頻率的輻射,所產生分子振動和轉動能級從基態到激發態的躍遷原理,對樣品進行檢測,根據產生的紅外光譜圖達到鑒定目的新技術［6-10］。該技術目前已在食源性致病菌檢測鑒定中被應用［11-14］。本研究針對2種豆類植物病原細菌-菜豆暈疫病菌（Pseudomonassaυastanoipv.phaseolicola）以及豌豆細菌性疫病菌（Pseudomonassyringaepv.Pisi）進行了紅外光譜檢測鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

豌豆細菌性疫病菌菌株LMG579和菜豆暈疫病菌菌株LMG2245標準菌株,自于比利時根特大學微生物學試驗室（世界菌種協會）的惠贈。

試驗儀器有Nicolet5700紅外光譜儀（美國熱電公司）,氣浴震蕩儀,干燥濃縮儀,培養箱、顯微鏡、離心機等其他小型儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 干燥菌株制備

將菌株接種至NA培養基上,30℃培養12～24h；挑取單菌落接種至NB培養液中,30℃下180r·min-1培養12h,制成種子液,將20μL種子液均勻轉接至8mL的NB培養液中,30℃下180r·min-1培養24h；將菌懸液20℃下8000r·min-1離心4min；并用NaCl洗滌3次,得到菌體細胞,將其放入真空濃縮干燥器中使之完全干燥,每株菌制備2個干燥菌株樣品。

1.2.2 紅外檢測流程

以1∶100的比例,將制備好的干燥菌株樣品溴化鉀混合磨碎壓片（100kg·cm-2,1200psi）8 min,用紅外光譜測定。光譜分辨率為4cm-1,測量范圍500～4000cm-1,掃描信號累加32次,自動平滑處理,自動基線校正,掃描時實時扣除H2O和CO2的干擾,設不放入樣品的空背景作為背景,每測一樣品掃描背景1次,每樣品重復5次,取波普的平均值,光譜得到的數據用Grams32軟件分析。

2 結果與分析

由表1,2可以看出,在500～4000cm-1內,菌株5079和2245有2個相同的峰位為3396.36cm-1（3307.66cm-1）和1463.58cm-1（1401.29cm-1）,其吸收帶分別歸屬于O-H伸縮或N-H伸縮振動、C-H剪式和彎曲震動。另外,3548.21,3545.99,3516.18,3508.02, 3489.27,3473.10和3414.46cm-1為5079菌株所特有,前4個峰位歸屬于O-H（Monomeric或Hydrogenbonded）伸縮振動,后3個歸屬于N-H伸縮振動和O-H伸縮振動。2926.68,1651.83,1545.29, 1545.10,1241.66和1076.56cm-1的峰位為2245菌株所特有,分別歸屬于C-H伸縮震動和OH伸縮振動、C=C伸縮振動和NO2不對稱伸縮振動、NO2不對稱伸縮振動、NO2不對稱伸縮振動、C-O伸縮振動和C-O伸縮振動。

表1 豌豆細菌性疫病菌菌株LMG2245的主要官能團及其強度

表2 菜豆暈疫病菌標準菌株LMG2245的主要官能團及其強度

3 小結

用紅外光譜技術檢測菜豆暈疫病菌和豌豆細菌性疫病,結果顯示,兩菌光譜有明顯差異,光譜結果特異性強,在3000～4000cm-1內,分別具有特異性峰位,可作為生物標記供2種菌的鑒定使用。該方法檢測周期較短,僅為2h左右,檢測步驟簡潔,樣品前處理便捷,具有較好的應用前景。

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（責任編輯：張瑞麟）

O657

B

0528-9017（2014）02-0233-02

文獻著錄格式：徐曉鷗,吳志毅,陳曦,等.2種豆類植物病原細菌的紅外光譜檢測與鑒定［J］.浙江農業科學,2014（2）：233-235.

2013-10-28

浙江出入境檢驗檢疫局科研項目（ZK200996x,ZK201310）

徐曉鷗,在職碩士,從事植物檢驗檢疫工作。E-mail：xxo@yw.ziq.gov.cn。

吳志毅,博士,高級農藝師,從事植物檢驗檢疫工作。E-mail：wzy@ziq.gov.cn。