Hedeghog信號通路與胰腺癌治療研究進展

胡佳佳 李淑德 高軍

胰腺導管腺癌(簡稱胰腺癌)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占胰腺惡性腫瘤的90%以上，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，居歐美國家癌癥致死病因的第4位。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路(HH信號通路)在胰腺癌中有不同程度的異常活化，可能是胰腺癌的核心致病機制之一[1-2]。同時，該通路的異常活化對胰腺癌的惡性生物學特性的維持極為重要[3-6]，為研究胰腺癌的發(fā)生機制和治療方案提供了全新的方向。目前已經發(fā)現(xiàn)或合成的多種化合物，可以在不同的環(huán)節(jié)阻斷HH信號通路。本文就HH信號通路的阻斷劑及其在胰腺癌治療中的應用做一綜述。

一、Smo抑制劑

Smo抑制劑是目前HH信號通路阻斷劑研究的熱點。現(xiàn)分別就其在胰腺癌細胞株、胰腺癌干細胞、胰腺癌原位異種移植小鼠及藥物臨床試驗方面的研究進行概括。

1．胰腺癌細胞株：作為Smo特異性抑制劑，環(huán)巴明是第一個被發(fā)現(xiàn)，也是目前臨床最常用的HH信號通路拮抗劑。環(huán)巴明是一種從百合類植物中提取的甾體生物堿，通過與Smo的7次跨膜螺旋結合，靶向抑制Smo的活性，從而阻斷HH信號通路的轉導[7]。Thayer等[8]用環(huán)巴明與5株人胰腺癌細胞株進行共培養(yǎng)，結果2株Smo高表達細胞株的細胞密度和形態(tài)發(fā)生顯著變化，與對照組相比凋亡增加2.5～3.5倍，增殖率下降75%～80%。研究還顯示，HH信號通路非依賴的胰腺癌細胞株PANC1、BxPC-3，在給予環(huán)巴明干預后，并不能顯著抑制細胞增殖；而HH信號通路依賴的胰腺癌細胞株CFPAC-1，在對吉西他濱不敏感的情況下，環(huán)巴明仍然可以顯著抑制細胞增殖[8-9]。因此，環(huán)巴明可以引起高表達HH信號通路的胰腺癌細胞發(fā)生凋亡，然而對于不表達HH信號通路的胰腺癌細胞則無明顯作用，進一步證實環(huán)巴明對HH信號通路的特異性抑制作用，同時提示對環(huán)巴明不敏感的胰腺癌細胞可能是通過Smo下游通路發(fā)生激活性突變而維持其增殖的。Hu等[10]研究表明，環(huán)巴明能使胰腺癌細胞株中表皮生長因子受體(EGFR)的表達減少，單用環(huán)巴明，或聯(lián)合應用易瑞沙可抑制胰腺癌細胞系PANC1、SUIT 2和ASPC-1的細胞生長，誘導細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G0/G1期。兩者在抗胰腺癌細胞增殖中起協(xié)同作用。環(huán)巴明還能增強紫杉醇和放療對胰腺癌細胞的殺傷作用[11]。

KAAD-cyclopamine是環(huán)巴明的衍生物，同樣通過抑制Smo發(fā)揮抗HH信號通路的作用。胰腺癌MiaPaCa-2細胞經KAAD-Cyclopamine處理后，細胞中bax蛋白表達顯著上調，Glil蛋白及bcl-2蛋白表達顯著下調，細胞生長受限，凋亡增加，證實胰腺癌細胞內HH信號活性明顯受抑制。目前動物實驗中尚未發(fā)現(xiàn)其存在明顯不良反應。AZD8542是一種新型的Smo拮抗劑，Hwang等[12]研究表明，伴隨著HH信號通路下游核轉錄因子Gli1 mRNA表達上調，HH信號通路的激活，可促進胰腺星形細胞增殖。與胰腺癌細胞相反，胰腺星形細胞中Smo受體高表達，而HH配體低表達，AZD8542可抑制胰腺星形細胞的增殖，進而抑制胰腺腫瘤的生長及侵襲轉移。

2．胰腺癌干細胞：腫瘤干細胞與腫瘤侵襲、轉移、復發(fā)、放化療抗性等密切相關。胰腺癌干細胞僅占腫瘤細胞的0.2%～0.8%，但致瘤性最強，最早由Li等[13]分離鑒定(CD44+CD24+ESA+)。研究發(fā)現(xiàn)只需接種100個腫瘤干細胞即可在裸鼠形成移植瘤，與原發(fā)瘤在病理學上十分類似，并且在連續(xù)傳代中比例保持不變。胰腺癌干細胞中Shh表達較正常胰腺上皮上調46.3倍，而非干細胞僅上調4倍。HH信號通路在胰腺癌干細胞的維持和自我更新中起至關重要的作用。環(huán)巴明可顯著減少胰腺癌干細胞[9,13-15]。Jimeno等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)單用吉西他濱治療敏感性胰腺癌，雖然出現(xiàn)腫瘤退縮，但同時會引起腫瘤干細胞聚集，停藥后腫瘤又迅速生長。而聯(lián)合環(huán)巴明治療后，可誘導持續(xù)性的腫瘤退縮，清除腫瘤干細胞。Mueller等[15]的研究亦證實環(huán)巴明聯(lián)合雷帕霉素和吉西他濱可以使胰腺癌干細胞減少至檢測不到的水平，腫瘤轉移能力完全消失，存活細胞株亦完全失去致瘤性。

3．胰腺癌原位異種移植小鼠：Thayer等[8]用對環(huán)巴明敏感的胰腺癌細胞株接種裸鼠，并用環(huán)巴明進行瘤內注射治療，1周后治療組50%～60%腫瘤的生長受到抑制，腫瘤體積也明顯縮小。Feldmann等[9]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴明可通過下調Snail、Angl和IGF1的表達，上調E-eadherin的表達，抑制腫瘤新生血管形成，抑制上皮間質轉化，進而抑制異種移植胰腺癌的生長、侵襲與轉移。在胰腺癌原位異種移植小鼠中，吉西他濱治療組中3只發(fā)生脾轉移、1只發(fā)生淋巴結轉移；環(huán)巴明治療組中只有1只出現(xiàn)肺的微轉移灶；環(huán)巴明和吉西他濱聯(lián)合用藥組的所有小鼠均未出現(xiàn)轉移灶，并且原發(fā)性腫瘤顯著縮?。欢鴨渭儗φ战M的7只小鼠均發(fā)生多器官轉移[9]。他們的研究還發(fā)現(xiàn)，胰腺癌異種移植小鼠經環(huán)巴明治療后，中位生存期由原來的61 d延長至67 d，而且腫瘤侵襲轉移能力明顯受抑制[16]。IPI-926是人工合成的Smo拮抗劑，亦通過抑制Smo發(fā)揮作用。研究證實胰腺癌移植小鼠經IPI-926處理后，腫瘤細胞明顯密集，間質結締組織顯著減少，Ⅰ型膠原含量下降，腫瘤平均血管密度(MVD)顯著增高，幾乎達正常胰腺組織水平，腫瘤組織中吉西他濱代謝產物濃度增加了60%[17]。

4．藥物臨床試驗：GDC-0449是第一個進入臨床Ⅰ期試驗的Smo拮抗劑，其治療因進展或轉移而不適合手術或放療的基底細胞癌33例，2例得到完全緩解，16例部分緩解，有效率達55%，并未見劑量限制性毒性發(fā)生[18]。Lorusso等[19]的Ⅰ期臨床試驗證實，68例腫瘤患者中，33例基底細胞癌對GDC-0449有反應，2例患者完全緩解，而且不良反應輕微，如厭食、消瘦、脫發(fā)、低鈉血癥等。1例手術、放療、化療后發(fā)生全身廣泛轉移的髓母細胞瘤患者，給予誘導化療、自體干細胞移植、替莫唑胺和bevaeizumab等治療后依然不斷進展，采用GDC-0449治療2個月后，PET檢查示病灶幾乎完全消失，遺憾的是，1個月后復查，部分原有病灶復發(fā)并出現(xiàn)新病灶，提示腫瘤對HH抑制劑出現(xiàn)耐藥。這是由于Smo基因發(fā)生突變，保守的天冬氨酸殘基被替代，使GDC-0449無法和Smo結合抑制HH信號通路[20-21]。到目前為止已經開展了關于GDC-0449對胰腺癌治療療效評估的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗，但結果尚未見報道[22-23]。IPI-926亦在進展期實體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗中取得良好療效[24]。

二、HH蛋白拮抗劑

HH蛋白拮抗劑通過與HH蛋白結合阻斷信號通路的轉導，其主要包括Robotnikinin及SHH蛋白抗體5E1。5E1通過與SHH蛋白結合，阻斷SHH誘導的HH信號通路的活化，進而抑制胰腺癌細胞的生長。Bailey等[25]報道，用5E1處理小鼠的人胰腺癌原位移植瘤后，腫瘤體積明顯縮小，轉移率明顯下降。

三、Gli相關拮抗劑

Lauth等[26]報道，在HEK293細胞中通過瞬時轉染編碼Glil基因和Gli調控的熒光素酶報告基因的質粒cDNA，發(fā)現(xiàn)兩個小分子化合物128(GANT61)和129(GANT58)可以抑制NIH 3T3細胞通過Smo激動劑激活的內源性HH信號通路。此外，這兩個化合物可以降低SuFu-/-細胞中Glil和Hip1的表達，提示它們作用于SuFu的下游通路。Glil+細胞系(如胰腺腺癌PANC1)比低Glil細胞系(如肝細胞癌HepG2和白血病Jurkat)對GANT61/GANT58要敏感得多，前兩者抑制率為40%～50%，后兩者僅0～10%。用5 μmmol/L GANT61或GANT58處理PANC1細胞48 h可導致Glil和Ptch表達下降，Gli的抑制尤其明顯。而同樣濃度的環(huán)巴明只是輕微抑制Gli1/Ptch的表達，提示該細胞系HH信號通路活化發(fā)生在Smo下游。Fu等[27]研究表明，GANT61可以抑制胰腺癌細胞增殖，抑制Gli-DNA結合和轉錄活性，并通過激活caspase-3，裂解多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，誘導細胞凋亡。此外，GANT61通過上調E-cadherin，下調N-鈣黏蛋白、轉錄因子(包括Snail、Slug、Zeb1)，從而抑制上皮間質轉化。

四、Sulforaphane(SFN)

SFN是十字花科植物的活性成分。Rodova等[28]研究發(fā)現(xiàn)，SFN通過抑制Gli1、Gli2、Smo的表達，抑制HH信號通路的活性。SFN可以抑制SHH信號通路成分Nanog和Oct-4，抑制胰腺癌干細胞的自我更新。同時通過下調Bcl-2、Cyclin D2的表達及激活caspase-3和caspase-7，誘導胰腺癌細胞的凋亡。

除上述拮抗劑外，HH信號通路其他成員的干預對胰腺癌也有抑制作用，如抗Ptch l抗體能抑制HH信號通路和胰腺癌細胞增殖[29]。CUR61414作為Ptch 1抗體，經Williams等[30]研究證實，在皮膚基底細胞癌中，可抑制基底細胞腫瘤的生長，而對正常細胞無影響。但在胰腺癌中的研究尚未見此類報道。構建表達反義Smo的腺病毒載體也能抑制胰腺癌細胞生長[31]。Kim等[32]發(fā)現(xiàn)特異性激活肝X受體(1iver X receptors，LXR)可以抑制多能骨髓基質細胞和顱蓋骨細胞對Shh的反應性，降低Gli1的轉錄活性，從而抑制HH靶基因(Gill、Ptch1)表達。采用siRNA技術沉默LXR基因，可以減弱對HH靶基因表達的抑制作用，在不存在LXR的小鼠胚胎成纖維細胞中，LXR配體并不能抑制Hh信號通路，而把LXR基因導入這些細胞中即可重建這種抑制關系。由此提示，LXR或許可以成為HH信號通路的一個新的調控靶點。

HH信號通路與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，以HH信號通路為靶標的治療成為胰腺癌治療的新方法，然而盡管部分HH信號通路拮抗劑在胰腺癌的實驗治療中顯示出良好的應用前景，但亦給我們帶來許多新的思考。Morton等[33]報道由K-ras和HH聯(lián)合誘導的腫瘤細胞株，在應用HH信號通路拮抗劑后，盡管上述的信號通路被抑制，而腫瘤細胞仍可繼續(xù)增殖。又如應用HH信號通路拮抗劑后出現(xiàn)的快速耐藥現(xiàn)象，HH信號通路抑制劑的毒性問題等。因此深入探討胰腺癌發(fā)生的分子機制，以及HH信號通路與其他信號通路之間的相互作用，相信以HH信號通路為靶標的治療，仍然具有較為廣闊的應用前景。

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