孟魯司特對支氣管哮喘大鼠Th17細胞分化的影響及意義

張 南，袁曉梅，楊 洋，楊 爽，郭 敏，郭悅鵬

(1新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝453100;2新鄉醫學院第三附屬醫院)

免疫—炎癥機制是當前支氣管哮喘的主流發病學說之一［1］。近年來研究發現，輔助性 T細胞17(Th17細胞)及相關細胞因子在支氣管哮喘氣道炎癥和氣道重塑的形成過程中發揮重要作用。孟魯司特作為一種強效選擇性半胱氨酰白三烯1受體(CysLT1Rs)拮抗劑，是支氣管哮喘治療的一線用藥，已被列入國內外哮喘防治指南［2］。我們于2013年5～9月觀察了孟魯司特對慢性支氣管哮喘大鼠模型Th17細胞分化的影響，現分析結果并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡健康雄性清潔級SD大鼠，體質量140～150 g(新鄉醫學院實驗動物中心提供)。雞卵清蛋白(OVA，GradeⅡ，美國Sigma公司);氫氧化鋁(天津市瑞金特化學品有限公司);孟魯司特鈉片(10 mg/片，魯南貝特制藥有限公司，批號10130106);大鼠白細胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒(美國 R＆D Systems公司);抗大鼠單克隆抗體anti-CD4-FITC、anti-IL-17A-PE(美國Biolegend公司);酶標儀(MK3型，Thermo Scientific公司);流式細胞儀(FACS，美國 Beckmancoulter公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及干預 將30只大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組(對照組)、哮喘組、治療組，每組10只。哮喘組和治療組制作慢性支氣管哮喘模型:于第1、8 d腹腔注射 OVA和氫氧化鋁［Al(OH)3］干粉混合液 1 mL［含 OVA 100 mg、Al(OH)3100 mg］;于第15 d予2%OVA溶液噴霧激發，30 min/次，1次/d，連續激發8周。治療組于每次霧化激發前1 h予孟魯司特10 mg/kg灌胃，1次/d，共8周。對照組實驗第1、8 d用等量生理鹽水灌胃;于第15 d開始予生理鹽水吸入刺激，30 min/次/d，連續激發8周。

1.2.2 觀察項目 末次給藥后24 h內測定各組以下指標。

1.2.2.1 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細胞(PMN)總數及細胞分類 麻醉大鼠，分離氣管T形切口，插入塑料管并固定，用5 mL生理鹽水進行肺泡灌洗，收集BALF，反復2次(回收率約80%);離心BALF，沉淀細胞用1 mL生理鹽水重新懸浮，吹打均勻后計數PMN總數并行細胞分類(HE染色)，計算PMN、嗜酸性粒細胞(EOS)、單核巨噬細胞(Mf)及淋巴細胞(Ly)所占比例。

1.2.2.3 肺組織病理改變及氣道形態學參數 上述指標測定后處死各組大鼠，取左肺葉固定于4%多聚甲醛中，常規脫水、石蠟包埋及切片，HE染色后觀察肺組織病理特點。肺組織切片在顯微鏡下放大400倍，每張切片隨機選取直徑100～200 μm完整的小支氣管橫斷面3個，用醫學圖像分析軟件Imag-Pro Plus 6.0測定其基底膜周徑(Pbm)、總管壁面積(WAt)、平滑肌面積(WAm)，計算總管壁厚度(WAt/Pbm)、平滑肌厚度(WAm/Pbm)。

1.2.2.4 相關性分析 對 WAm/Pbm 及 BALF中PMN總數與TH17細胞比例、IL-17水平的相關性進行分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0軟件包進行統計學分析，數據均采用±s表示，行正態性檢驗和方差齊性檢驗，方差齊數據兩樣本均數進行t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析;方差不齊采用校正t檢驗，多重比較時采用SNK-q檢驗;兩變量的相關分析采用Pearson直線相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 BALF中PMN總數及細胞分類 哮喘組BALF中PMN總數及PMN、EOS所占比例均高于對照組和治療組(P均＜0.01);治療組均明顯少于哮喘組，但明顯高于對照組(P均＜0.01)。見表1。

表1 各組BALF中PMN總數及細胞分類(n=10，±s)

表1 各組BALF中PMN總數及細胞分類(n=10，±s)

注:與對照組比較，#P ＜ ＜0.01，與哮喘組比較，△P ＜0.01

組別 細胞總數(×109/L)PMN總數(×108/L)細胞分類(%)PMN EOS Mf Ly對照組 3.53 ±0.400 2.86 ±0.40 8.09 ±0.89 1.19 ±0.30 82.87 ±1.75 7.85 ±2.10哮喘組 6.73 ±0.45# 10.81 ±0.95# 16.05 ±0.60# 7.55 ±0.79 76.01 ±1.61# 12.71 ±1.43治療組 4.82 ±0.52#△ 5.30 ±0.74#△ 10.97 ±0.64#△ 2.16 ±0.29#△ 63.68 ±0.59#△ 10.85 ±2.51#△

2.2 Th17細胞比例及血清IL-17水平 哮喘組Th17細胞比例高于對照組及治療組(P均＜0.01)，治療組高于對照組而低于哮喘組(P均＜0.01)。哮喘組血清IL-17水平高于對照組和治療組(P均＜0.01)，而治療組高于對照組但低于哮喘組(P均＜0.01)。見表 2。

表2 各組Th17細胞比例及血清IL-17 水平(n=10，±s)

表2 各組Th17細胞比例及血清IL-17 水平(n=10，±s)

注:與對照組比較，#P ＜0.01，與哮喘組比較，△P ＜0.01

組別 Th17細胞比例(%) IL-17(pg/mL)對照組0.76 ±0.73 20.36 ±0.99哮喘組 1.95 ±0.22# 76.31 ±1.46#治療組 1.43±0.34#△ 42.25±0.90#△

2.3 肺組織病理改變氣道形態學參數 對照組細小支氣管及肺泡結構正常，支氣管纖毛排列整齊，支氣管黏膜上皮完整，未見或少見炎癥細胞浸潤;哮喘組可見細支氣管上皮細胞腫脹，杯狀細胞增生，部分上皮細胞變性、壞死脫落;支氣管管壁增厚、管腔狹窄甚至完全閉塞，支氣管腔內大量黏液分泌，黏液栓形成;支氣管管腔、管壁黏膜及黏膜下、肺間質可見大量炎癥細胞(PMN、EOS、Ly)浸潤;治療組上述氣道改變癥狀較哮喘組明顯減輕，氣管壁黏膜有輕度炎癥細胞浸潤。各組Pbm比較無明顯差異。哮喘組WAt/Pbm及WAm/Pbm均明顯高于對照組及治療組(P均＜0.01)，治療組高于對照組、但低于哮喘組 (P均＜0.01)。見表3。

表3 各組氣道形態學參數比較(n=10，±s)

表3 各組氣道形態學參數比較(n=10，±s)

注:與對照組比較，#P ＜0.01，與哮喘組比較，△P ＜0.01

組別 Pbm(μm)WAt/Pbm WAm/Pbm對照組495.40 ±32.85 24.46 ±1.51 6.55 ±0.75哮喘組 537.17 ±41.06 50.97 ±3.48# 13.53 ±2.31#治療組 518.98 ±30.64 38.12 ±2.95#△ 8.25 ±0.97#△

2.5 相關性分析 WAm/Pbm與TH17細胞比例及IL-17水平呈顯著正相關(r=0.803，P ＜0.01;r=0.893，P ＜0.01)。BALF中 PMN 與 TH17細胞比例及 IL-17水平呈顯著正相關(r=0.870，P ＜0.01;r=0.975，P ＜0.01)。

3 討論

支氣管哮喘的發生涉及多種細胞因子、化學因子和相關細胞成分，是一種與免疫功能紊亂有關，以氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為重要特征的慢性疾病［3］。氣道重塑是呼吸道反復炎癥損傷與修復的結果，可導致不可逆性呼吸道阻塞及肺功能損害，是難治性哮喘的主要病理基礎［4］。

研究證實，EOS浸潤是引起哮喘的中心環節，但越來越多的研究顯示，PMN引起的氣道炎癥也起重要作用，尤其在重度哮喘的氣道炎癥和重塑過程中可能起重要作用［5］。在哮喘的發病過程中，活化的PMN產生各種酶、細胞因子和炎性介質，如中性粒細胞彈性蛋白酶、基質金屬蛋白酶(MMPs)、IL-8、IL-6、血小板活化因子、轉化生長因子-β、白三烯(LT)等，參與黏液腺增生和黏液栓形成、氣道重構和免疫調節等過程［6］。本研究哮喘組 BALF中PMN、EOS均明顯高于對照組，證實PMN參與了氣道炎癥和氣道重塑過程。

Th17細胞是新近發現的一類 T細胞亞群，IL-17是其分泌的特征性細胞因子。最新研究顯示，IL-17參與了哮喘的發生、發展，可能是激素抵抗型哮喘或重癥哮喘的重要發病機制之一［7］。作為一種前炎癥因子，IL-17具有很強的促炎癥作用，可以促進支氣管纖維母細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、基質細胞等活化和成熟，使這些細胞高度表達分泌IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、腫瘤壞死因子γ(TNF-γ)、單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白(MIP-2)、MMPs，從而促進炎癥細胞的聚集和慢性炎癥的產生，造成免疫炎癥損傷［8］，還可增加氣道高反應程度［9］。Wilson 等［10］研究顯示，IL-17 可促進PMN活化和趨化，加重氣道炎癥，參與氣道重塑。本研究結果顯示，哮喘組BALF中PMN、WAt/Pbm、Am/Pbm、Th17細胞比例、血清IL-17水平均明顯高于對照組，提示Th17細胞及IL-17參與了哮喘的發生，與目前研究報道一致。

半胱氨酰白三烯(CysLT)是哮喘發生發展過程中的主要炎性反應介質，通過與各種靶細胞上Cys-LT1Rs結合，促進呼吸道內炎性反應細胞聚集和黏液分泌，增加血管通透性和氣道高反應性，引起呼吸道平滑肌收縮，促進呼吸道結構細胞損傷和增殖，從而參與呼吸道炎性反應及重塑的發生過程［11，12］。孟魯司特是一種強效選擇性CysLT1Rs拮抗劑，能與人體呼吸道中CysLT1Rs高度選擇性結合，阻斷Cys-LT的病理作用，抑制氣道炎癥，降低氣道高反應性，抑制氣道重塑［13，14］。Wang 等［15］報道，自身免疫性腦脊髓炎動物模型中CysLT1受體信號不影響致病性輔助性T細胞的分化，孟魯司特卻可以抑制髓鞘少突膠質細胞糖蛋白特異性T細胞中IL-17的分泌。本研究結果顯示，孟魯司特可使OVA致敏哮喘大鼠氣道炎癥及平滑肌厚度增厚程度減輕，對氣道重塑有明顯的抑制作用;同時可抑制Th17的分化及IL-17釋放，使BALF中PMN減少，減輕炎癥細胞在支氣管內的積聚。

綜上所述，孟魯司特可減輕哮喘大鼠的氣道炎癥及抑制其氣道重塑;其機制可能為抑制Th17細胞活化，減少IL-17的合成和釋放。

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