慢病毒載體PLKO.1-shHIF-2α的構(gòu)建及鑒定

劉鵬飛，崔春萍，門同義

(1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟南250021;2濟南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院;3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所;4山東省千佛山醫(yī)院)

近20年來腎細胞癌的發(fā)病率和病死率不斷升高［1，2］，已經(jīng)成為男性中第 7、女性中第 8 位的常見癌癥。研究證實，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)在腎癌的發(fā)生中起重要作用，其作為轉(zhuǎn)錄因子參與血管生成、腫瘤細胞的增殖、細胞的遷移等過程［3］。HIF由一個α 亞基(HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α)和一個 β 亞基組成。β亞基作為結(jié)構(gòu)單位穩(wěn)定存在，而α亞基作為功能單位很不穩(wěn)定，只有在低氧環(huán)境中存在;最近的研究表明HIF-2α在腎細胞癌的致癌中起重要作用。為研究HIF-2α表達對下游靶基因、細胞生物學(xué)特征和致癌能力的影響，我們構(gòu)建了帶綠色熒光蛋白(GFP)并穩(wěn)定干涉 HIF-2α的 PLKO.1-shHIF-2α的慢病毒載體，并對所得產(chǎn)物進行了鑒定。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2×Taq PCR MasterMix試劑購于北京莊盟生物公司，凝膠回收試劑盒購于 Promega公司;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京天根生物科技公司;大劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自Vigorous公司;小劑量質(zhì)粒提取試劑購自威格拉斯公司。限制性內(nèi)切酶 BamHl HF 、Spel HF、Agel、EcoRl和 T4 DNA 快速連接試劑盒購自NEB公司。人786-0細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫，質(zhì)粒 PCDH、PLKO.1-puro、pMD2G，pSAX2及293FT細胞均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所保存。引物設(shè)計:HIF-2α干涉片段上下游引物分別為:5'-CAACCTGCAGCCTCAGTGTATC-3'和5'-CACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。根據(jù)NCBI提供的PLKO.1-puro病毒包裝構(gòu)建手冊合成包裝慢病毒的片段(北京奧克生物技術(shù)公司合成)，序列如下:5'-CCGGCAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGATTTTTTG-3'和5'-AATTCAAAAACAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。以質(zhì)粒PCDH為模板，設(shè)計EF1-EGFP片段上下游引物分別為:5'-GGACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGT-3'(含 Spel酶切位點)和 5'-CGGGATCCGCGAGATCCGGTGGAGCCGGGT-3'(含BamHl酶切位點)，由北京奧克公司進行合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因HIF-2α干涉片段和EF1-EGFP片段獲取 體外合成的單鏈HIF-2α干涉片段經(jīng)過退火后形成雙鏈片段(95℃ 4 min，70℃ 10 min)。以PCDH質(zhì)粒為模板，擴增EF1-EGFP片段，用2×Taq PCR MasterMix實行 PCR(94℃、30 s，60℃、2 min，35個循環(huán);72℃延長10 min)，PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳后膠切割并膠回收，得到EF1-EGFP片段，預(yù)計約為 1.3 kb。

1.2.2 帶GFP的慢病毒載體質(zhì)粒PLKO.1-shHIF-2α的構(gòu)建 分別用AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切目的片段干涉HIF-2α序列和PLKO.1-puro質(zhì)粒(37℃水浴3 h，70℃滅活20 min)，采用T4 DNA連接酶連接上述雙酶切的膠回收產(chǎn)物(16℃水浴18 h)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取陽性菌落，擴增后提取質(zhì)粒。AgeⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定(37℃水浴2 h)，預(yù)計得到1.9 kb的片段。鑒定連接成功后，將質(zhì)粒與EF1-EGFP片段分別用BamHl HF和Spel HF雙酶切。再次用T4 DNA連接酶連接上述雙酶切的膠回收產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取陽性菌落，擴增后提取質(zhì)粒。BamHl HF和Spel HF雙酶切鑒定，預(yù)計得到1.3 kb的片段。

1.2.3 慢病毒載體 PLKO.1-shHIF-2α 的包裝及濃縮 具體方法參照文獻［4］。采用磷酸鈣沉淀法將載體質(zhì)粒 PLKO.1-shHIF-2α 與 pMD2G，pSAX2共轉(zhuǎn)染293FT細胞。轉(zhuǎn)染12 h后更換完全培養(yǎng)基，72 h后收集上清液，無菌濾器過濾后得病毒原液。將病毒原液在超速冷凍離心機中3 000 r/min、4℃ 離心30 min，棄上清液，再以合適體積的IMDM重懸沉淀，使病毒顆粒充分懸浮，得到病毒濃縮液。整個過程在冰水混合物中進行，分裝后 －80℃凍存。

1.2.4 慢病毒載體 PLKO.1-shHIF-2α 的鑒定 在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)786-0細胞，細胞達80%匯合后傳代。收集適量的處于對數(shù)生長期的786-0細胞，加入96孔板中，每孔再加入不同稀釋倍數(shù)的病毒濃縮液，48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 EF1-EGFP片段擴增結(jié)果 以PCDH為模板，PCR擴增出了帶BamHl和Spel接頭的EF1-EGFP片段，電泳顯示條帶大小與預(yù)期一致。見圖1。

圖1 EF1-EGFP片段PCR擴增結(jié)果

2.2 PLKO.1-shHIF-2α 干涉HIF-2α 片段鑒定 連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a約長出10個菌落，提取菌落質(zhì)粒，用Agel和EcoRl雙酶切后電泳可見1.9 kb片段，表明PLKO.1-shHIF-2α 干涉HIF-2α片段連接成功。見圖2。

圖2 PLKO.1-shHIF-2α干涉HIF-2α片段

2.3 PLKO.1-shHIF-2α EF1-EGFP片段的鑒定 連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a約長出5個菌落，提取菌落質(zhì)粒，用BamHl HF和Spel HF雙酶切后電泳可見1.3 kb片段，表明 PLKO.1-shHIF-2α 的EF1-EGFP片段連接成功。見圖3。

圖3 PLKO.1-shHIF-2α EF1-EGFP片段

2.4 測序結(jié)果 各連接點正確，序列與已知序列相符，表明干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段已正確插入PLKO.1-puro質(zhì)粒中，證實 PLKO.1-shHIF-2α質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.5 細胞感染效率 不同稀釋度的病毒濃縮液感染786-0細胞48 h后，在倒置熒光顯微鏡下可見96孔板內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光。以103稀釋度和106稀釋度為例，后者較前者熒光強度明顯降低，見圖4。

3 討論

近來研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α在腎細胞癌中存在異常表達，與腎細胞癌發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。Mandriota等［5］研究發(fā)現(xiàn)在腎透明細胞癌中檢測到更高的 HIF-2α表達，且表達增加與進展期腫瘤損害程度有關(guān)。Sowter等［6］研究證實，HIF-2α 的表達主要出現(xiàn)在腎透明細胞癌細胞中;研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-2α與VHL、VEGF、TGF-α及cyclin-D1表達均有密切關(guān)系［7］。因此，為進一步研究HIF-2α表達對RCCs的生物學(xué)作用，以及其對下游靶基因的調(diào)控，建立穩(wěn)定干擾HIF-2α的細胞株是必要的。

圖4 慢病毒載體感染786-0細胞48h的鑒定后GFP的表達

本研究中我們使用RNA干擾(RNAi)方法成功構(gòu)建了帶GFP的HIF-2α干涉載體。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象，能夠使基因表達的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠強于正義和反義RNA［8］，在治療腫瘤及病毒感染方面也展現(xiàn)了相當(dāng)好的前景［9］。慢病毒載體作為最近實驗室經(jīng)常采用的一種新型病毒載體，其優(yōu)點是具有獲得病毒滴度高，周期短，可以感染非分裂細胞、分裂細胞，而且能夠整合到宿主基因組中，從而穩(wěn)定的表達目的基因等特點。慢病毒干涉載體的技術(shù)是將慢病毒載體的特點和RNAi技術(shù)的優(yōu)點結(jié)合到了一起，從而使得其能夠整合到宿主基因組從而發(fā)揮穩(wěn)定的RNA干涉效果，使得在基因功能領(lǐng)域研究中RNA干涉技術(shù)的應(yīng)用和作用得以更廣泛的發(fā)揮。本研究應(yīng)用的PLKO.1-puro是一種復(fù)制缺陷型慢病毒載體，可以直接通過轉(zhuǎn)染操作被導(dǎo)入細胞，已經(jīng)被作為常規(guī)RNAi載體使用，也可以被包裝成慢病毒顆粒，然后感染細胞。其一旦進入細胞內(nèi)，就可以整合到基因組中，穩(wěn)定表達shRNA和具有Puromycin抗性，Puromycin抗性基因的篩選可以殺滅掉沒有整合慢病毒載體的細胞且不穩(wěn)定表達的細胞，從而得到基因組中有整合慢病毒載體的穩(wěn)定的細胞系。同時GFP性質(zhì)穩(wěn)定，通常不影響目的基因表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性，能根據(jù)GFP融合蛋白的綠熒光的分布來分析目的蛋白在細胞中的分布和定位，并且可以利用熒光顯微鏡直觀地判斷轉(zhuǎn)染效率，有利于篩選目的基因和GFP共表達的陽性細胞，從而得到持續(xù)表達該目的基因的細胞株［10］。我們在熒光顯微鏡下觀察到較強的綠色熒光，提示該融合質(zhì)粒能在腎癌786-0細胞中成功表達，從而為進一步探究HIF-2α對腎癌細胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。

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