貼壁細胞電阻抗譜等效電路模型的建立與分析*

焦 泉，胥善治，楊生勝，秦曉剛，王 鵬*

(1.清華大學精密儀器系，北京100084;2.蘭州空間技術(shù)物理研究所真空低溫技術(shù)與物理重點實驗室，甘肅蘭州730000)

0 引言

細胞貼附是細胞生長、遷移、細胞間連接形成、代謝、分裂、分化和凋亡等組織或腫瘤形成過程的初始步驟。基于生物方法的檢測，如采用標記，都是基于終點的檢測，并且會對細胞產(chǎn)生一定影響。細胞電生理研究采用電學方法研究細胞的生理狀態(tài)的改變，其中很重要的一種方法是細胞電阻抗傳感，它在藥物篩選和臨床診斷方面有很大作用。

細胞電阻抗傳感檢測(electriccell-substrate impedance sensing，ECIS)最早是由Giaever 和Keese 兩個人［1］在1984年提出，細胞在金電極上貼附生長會改變電極溶液的整體阻抗，他們使用細胞電阻抗來監(jiān)測細胞在金電極上的繁殖和形態(tài)變化，這種方法的特點是實時、非侵入式和無標記性。Giaever 和Keese 所使用的測量電極形式是一個小面積(3 ×10-4cm2)的工作電極與一個大面積(2 cm2)的參比電極，測量4 kHz 頻率下阻抗隨時間的變化，并建立相應的分析模型［2-3］。采用小面積測量電極進行檢測時，由于電極面積很小，細胞不容易分布均勻，且每次測量位置不同會對結(jié)果產(chǎn)生很大影響，導致實驗的重復性較差。而后在1997年Ehert［4］首次全面報道了叉指電極(IDE)檢測細胞行為的研究，相比于小面積的單點電極，叉指電極的覆蓋面積大，實驗重復性好，多用于細胞毒理的研究。在細胞阻抗的研究中，大多使用單頻點下的阻抗隨時間的變化來反應細胞的生長變化，其中就涉及到頻率點的選取問題，頻率點的選取，最開始Giaever 對于頻率點的選擇原因沒有做出說明，不同頻率點的選擇對于結(jié)果會有影響，其后的研究中，所采用的頻率點選擇方法通常是先測量一個寬頻率(通常1 Hz～1 MHz)下的無細胞溶液電阻抗譜與有細胞溶液電阻抗譜，選取細胞有無狀態(tài)下阻抗幅值差值最大所在的頻率點，測量該頻率點下細胞阻抗值隨時間的變化來評定細胞生長狀態(tài)［5］。這種方法簡化了測量過程，對于藥物檢測也有實際的作用。

在本研究開展的工作中，筆者所采用的電極形式是叉指電極，實驗所測量數(shù)據(jù)是細胞溶液的電阻抗譜，由此建立細胞溶液的等效電路模型，分析模型參數(shù)隨時間的變化情況，給出細胞貼附生長生理變化與等效模型參數(shù)變化之間的對應關(guān)系，相對于單頻點的測量，本研究所使用的方法能夠給出關(guān)于細胞貼附生長更加全面的生理信息。

1 理論分析

使用電極測量細胞阻抗時，首先需分析無細胞存在時電極與溶液之間的阻抗。按照電化學理論的解釋，溶液電化學反應包含兩個過程，一個是離子從溶液擴散在電極界面，這是傳質(zhì)過程;然后離子在電極上發(fā)生反應，這是活化過程。整個電化學反應模型可以用經(jīng)典Randles 電路表示，該等效電路模型如圖1所示。

圖1 Randles 等效電路模型

Rp和W 一起成為法拉第阻抗，包含的是電化學反應過程的阻抗。該電路中，Rs和Cdl近似于是理想的電路元件，而Rp和W 阻抗并非是理想的元件，它們與測試頻率之間還有一定的關(guān)系。

上述基礎等效電路分析的是典型的電化學反應過程，該過程中電極與溶液會發(fā)生氧化還原反應，而在生物實驗中，由于使用的金電極是惰性電極，電極上基本上不發(fā)生氧化還原反應，即法拉第阻抗很大。

McAdams［6］等人的研究表明，等效電路可以簡化為如圖2所示的等效電路模型。

圖2 簡化后電極溶液界面等效電路模型

根據(jù)圖2 的等效模型可知，即電極溶液界面的阻抗等效為一個常相角元件CPE，它的阻抗表達式為:

式中:K—與溶液特性相關(guān)的參數(shù)，包括溶液濃度、溶液體積等因素;β—與電極屬性相關(guān)的參數(shù)，包括電極的材料、電極表面粗糙度等。

生物細胞由細胞膜包裹細胞液組成，細胞液含有離子，導電性較好，而細胞膜是磷脂雙分子結(jié)構(gòu)，磷脂雙分子層導電性很差，上面分布著各種類型的通道，水分子與離子只能通過相應的特殊通道進出細胞，這導致細胞膜的導電性很差。而由于水化作用的存在會使得細胞膜表面形成雙電層，整體細胞帶有一定量的靜電荷，最終使得細胞整體容抗很大、電導很小［7］。文獻［7］表明細胞整體電容率達到0.5 μF/cm～1.3 μF/cm，電導率達到102Ω·cm2～105Ω·cm2。子宮頸癌Hela 細胞具有貼壁特性，它在培養(yǎng)液中需先貼附到培養(yǎng)器皿的底部器壁上，而后才能進行正常生長繁殖。細胞接入培養(yǎng)皿初始時分，細胞懸浮于溶液中，整體呈球狀，然后開始貼附過程，細胞與容器底部發(fā)生物理接觸，整體舒展，貼附完成后，細胞整體呈梭形附著在容器底部，此時細胞膜與電極之間的間距達到10 nm～20 nm。按照此前的研究結(jié)果，細胞對電極的貼附會改變電極流出電流的通路，Giaever 和Keese建立了一個基于電流流向分布的數(shù)學解析模型，該模型參數(shù)能夠?qū)崟r表征細胞生長狀態(tài)的變化。

其后，Wengener［8］利用等效電路對實驗數(shù)據(jù)進行了分析，Cho［9］將CPE 模型用于表征細胞膜阻抗，胡朝穎等［10］提出的等效分析電路如圖3所示。對比經(jīng)典Randles 等效電路模型，圖3(a)所示模型增加了細胞電極間隙的阻抗以及細胞本身的阻抗;圖3(b)所示模型將間隙阻抗與細胞阻抗統(tǒng)一簡化成為一個整體，用于表征由于細胞存在對模型整體帶來的影響。

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圖3 細胞貼附前后等效電路圖

綜合上述分析，得到的細胞貼附等效電路模型如圖4所示。

圖4 細胞貼附叉指電極等效電路

2 材料與方法

2.1 細胞阻抗測量裝置的研制

細胞阻抗測量裝置主要感應部分是叉指金電極，電極的外觀結(jié)構(gòu)圖如圖5所示。其中，電極整體外觀如圖5(a)所示。圖5(a)中，一塊電極上面有4 個感應電極，組成四通道傳感器。單通道電極的形狀和主要結(jié)構(gòu)參數(shù)如圖5(b)所示。主要的參數(shù)有兩個，分別是叉指電極的寬度D 和電極間距W，實驗所用的電極芯片參數(shù)為:D=20 μm，W=100 μm。電極采用微電子加工技術(shù)獲得，在硅玻璃基底上加工出20 μm 厚度的鈦和200 μm 厚度的金，鈦的存在是為了增大金和硅玻璃之間的附著。

圖5 叉指電極外觀結(jié)構(gòu)

為了實時培養(yǎng)細胞和施加電信號，需要增加培養(yǎng)結(jié)構(gòu)和電路連接結(jié)構(gòu)，制備完整的細胞培養(yǎng)腔。細胞培養(yǎng)整體結(jié)構(gòu)構(gòu)成如圖6所示。

圖6 細胞培養(yǎng)整體結(jié)構(gòu)

2.2 細胞阻抗譜測試系統(tǒng)

細胞阻抗譜測試系統(tǒng)構(gòu)成圖如圖7所示。細胞測量裝置整體置于培養(yǎng)箱中，來對細胞進行實時地培養(yǎng)和測量。傳感器芯片通過杜邦線與電化學工作站(Parstat 4000)相連，在計算機界面上對Parstat 4000 進行控制，使得Parstat 4000 施加幅值為20 mV，頻率為1 Hz～1 MHz 的交流電壓給測量裝置，響應信號被Parstat 4000 采集后，經(jīng)過處理，最后得到阻抗譜數(shù)據(jù)。

圖7 細胞阻抗譜測試系統(tǒng)

2.3 Hela 細胞培養(yǎng)與測量

實驗所采用的的細胞是Hela 細胞，將Hela 細胞接種于含有10% 的胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)溶液中。整體測量裝置置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10 h，每隔一小時測量一次阻抗譜。在放入培養(yǎng)箱1 h 時與10 h 時這兩個時刻對細胞進行顯微拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 細胞生長狀態(tài)

本研究選取Hela 細胞為實驗材料。因Hela 細胞對表面要求不高，無需做表面處理即可良好貼附生長，接種細胞1 h 時與接種10 h 時顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)如圖8所示。由圖8 可知，接入細胞1 h 時，細胞多懸浮在電極表面，呈圓形顆粒狀;而在接入細胞10 h時，細胞已經(jīng)在電極表面貼附，并且伸展開呈單層生長狀態(tài)，細胞呈梭形狀態(tài)。從細胞分布來看，電極區(qū)域與非電極區(qū)域并無明顯分布差異。

圖8 Hela 細胞加入芯片后顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)

3.2 模型參數(shù)分析

本研究測量0 h～10 h 的阻抗譜，每隔1 h 測量一次，總共得到11 組數(shù)據(jù)。筆者使用圖4所示等效電路對第一組數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，在高頻區(qū)段，實際測量相角出現(xiàn)負值，而圖4 等效電路不會出現(xiàn)該種狀況。

圖9 修正后的細胞溶液阻抗譜等效電路圖

針對修正前后的等效電路模型，本研究對0 h 時的阻抗譜數(shù)據(jù)進行擬合，兩次擬合結(jié)果的比較情況如表1所示。對比結(jié)果可知，修正模型的擬合結(jié)果標準差遠小于原模型，擬合效果更優(yōu)，即選用修正模型能夠更好地擬合實驗數(shù)據(jù)。

表1 初始模型與修正模型擬合結(jié)果參數(shù)對比

本研究使用修正模型對測量的11 組數(shù)據(jù)進行擬合，得到不同時刻的7 個模型參數(shù)，以10 h 時的參數(shù)為標準參數(shù)，將0 h～10 h 的模型參數(shù)與之相除，得到標準化的模型參數(shù)，繪制標準化模型參數(shù)與時間的關(guān)系，如圖10所示。

圖10 阻抗譜等效電路模型標準化參數(shù)的變化

整體上將參數(shù)分為兩組:第一組參數(shù)反映電極和溶液的固有性質(zhì)，包含L、Rs、K、β;第二組參數(shù)反映細胞帶來的影響，包含R1、K1和β1。

第一組參數(shù)中，參數(shù)變化分成兩種。參數(shù)L 開始變化很大，可能是由于培養(yǎng)溫度變化引起，其后7 h 保持平穩(wěn)，最后2 h 上升可能是線路抖動產(chǎn)生。另外3個參數(shù)Rs，K，β 全過程變化不超過5%，這3 個參數(shù)反映的是溶液電極固有性質(zhì)，在實驗過程中，電極本身沒有變化，細胞生長消耗了培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)，而細胞內(nèi)外離子濃度保持平衡，培養(yǎng)液的電特性不變，所以這幾個參數(shù)變化不大。

第二組參數(shù)R1、K1，β1變化明顯。如圖10所示，3個參數(shù)隨時間是一個線性變化過程，因此可以用3 個參數(shù)的變化來反應細胞的生長貼附狀況。細胞本身相當于一個容性元件，溶液相當于阻性元件，故R1反應的是細胞與電極之間溶液的變化，電流流向與電極表面平行，由于貼附，導致間隙溶液的橫截面減小，電阻增大。細胞貼附過程，細胞本身形狀變扁，類比于平板電容，電容值與面積成正比，與電極間距成反比，由于細胞變扁，細胞附著在電極上的膜與未附著的膜之間距離變小，而面積變大，最終K1值增大，β1減小。

4 結(jié)束語

本研究組裝出了能實時、連續(xù)獲得細胞電阻抗譜的測量裝置。

實際HeLa 細胞實驗結(jié)果表明，細胞阻抗測量裝置能夠?qū)毎N附進行實時監(jiān)測，為細胞電生理如細胞活性檢測盒藥物篩選等提供了一種無損、快速的方案。同時，針對實驗中獲得的阻抗譜數(shù)據(jù)，筆者使用等效電路對其分析，提出修正等效電路模型，用于分析細胞貼附過程生理改變。相較于單頻點阻抗變化，該方法提供了更全面的細胞生理信息。

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