分子生物學技術檢測自然流產組織染色體異常

韓 松，林艷茹，馬曉艷，滕 紅

（吉林大學第二醫院 婦產科，吉林 長春130041）

自然流產是婦產科的一種常見病，目前國內的定義是指妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000g而終止者，發病的幾率約為15%－40%[1]。在導致早期自然流產的眾多因素中最常見的是染色體的異常，約占60%[2]。本文就近幾年對染色體異常的多種檢測技術的應用進展進行綜述。

染色體的異常包括染色體結構異常和染色體數目異常，而數目異常則是最常見的原因。目前，臨床應用最廣泛的是絨毛培養結合染色體核型分析技術，能夠發現所有染色體的數目異常和結構異常。但缺點是細胞培養周期長，需無菌取材、操作，對實驗室、技術人員要求較高，另外對母源組織的污染也難鑒別等。同時這種方法還受分裂相數量、質量等的影響。自然流產組織一般都具有組織陳舊、容易污染、培養失敗率較高等自身特點，限制了此方法在臨床中的廣泛應用。

近幾年，隨著分子生物學技術的不斷進步，新技術、新方法層出不窮被逐漸應用于臨床，為各種疾病的診斷提供重要依據和創新思路。目前，檢測染色體異常的技術主要有SKY、FISH、羊膜腔穿刺培養、QF－PCR、MLPA等。

1 FISH技術檢測染色體異常的應用

1.1 熒光原位雜交技術檢測染色體異常的應用熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）技術是20世紀80年代末興起的細胞遺傳生物學方法中的一種新型技術，它采用特殊熒光素標記的DNA探針，對未培養的絨毛組織按照同源互補原則進行原位雜交，雜交后經過免疫顯色，就能快速準確的判斷染色體顏色和數目的異常。

1.2 FISH檢測染色體異常的優勢 在自然流產組織中染色體非整倍體異常是最常見的畸變類型，如21三體、18三體、性染色體及多倍體，嵌合體等，約占50%－60%[3，4]。①FISH 技術可直接應用于未培養絨毛細胞的分裂中期、間期分裂相等階段②相比傳統的G顯帶核型分析技術的費時耗力，FISH則只需在采集標本1－2個小時后即可做出診斷，明顯縮短了檢測時間。③早期自然流產組織培養失敗率為5%－42%[5，6]，對于自然流產組織的陳舊，易污染，培養的時間長失敗率高[7]等問題，FISH則是解決它們很有效的手段。④在傳統方法檢測染色體中無法辨別的染色體異常的病例，如染色體的突變，染色體的微缺失等方面的異常，FISH則能快速準確的做出診斷，具有特異性強，靈敏度高等優點。方小武、李紅艷等檢測了30例培養失敗的絨毛組織標本，應用FISH技術檢出染色體數目異常14例，使檢測的準確率提高[8]。FISH技術用于檢測自然流產組織染色體的異常時，避免了標本易污染導致的細胞培養失敗、培養過程中染色體的變異等缺點，省去了制備染色體DNA和顯微鏡下分析核型等繁瑣的過程，能快速診斷疾病，減少了患者焦慮的等待時間，具有較高的靈敏度和特異性。

1.3 FISH技術檢測染色體異常中的缺點 應用FISH技術檢測染色體異常時雖然有很多自身優勢，但也因各方面的限制使其仍不能完全取代傳統細胞遺傳學方法，臨床上若將FISH與常規染色體核型分析聯合應用，則可為臨床疾病的診斷提供更準確的依據。①探針種類有限，只能檢測幾種常見的非整倍體染色體異常，使得一些特異性區域無法檢測而造成漏診，因此商品化的探針數目有限而使FISH在應用上受到一定的限制。②可有假陽性或假陰性結果出現，即使是正常染色體標本，在FISH試驗中也會出現異常的情況.③母體細胞受到污染時，FISH則不能準確檢測到存在母體污染的女性胚胎。④價格昂貴，探針和實驗儀器價格昂貴，對實驗室條件要求高等。

2 CGH、QF－PCR、MLPA

2.1 CGH在檢測染色體異常中的應用 CGH

（comparative genomic hybridization）比較基因組雜交技術，是一種新型的細胞遺傳學技術，它是一種快速、系統、全方位的檢測方法，可以檢測整個基因組內染色體的獲得與丟失。最初主要應用于腫瘤遺傳方面的研究[9]，現被證實它也可以應用于臨床細胞遺傳學研究[10－13]。

臨床上自然流產組織的標本，不僅培養失敗率高，且大多數不能及時檢測，而CGH分析檢測陳舊組織時僅需要DNA，不需要培養，可直接從標本中獲得，這樣就可避免培養失敗；CGH可直接對冰凍組織、陳舊組織等儲存樣本進行研究，只需少量的樣本就可以對整個基因組染色體數目的變化做出診斷，具有較高的準確率。作為一種在FISH基礎上發展起來的新型技術，它彌補了FISH探針種類有限和檢測位點局限的缺點。

目前CGH技術已被廣泛應用于自然流產組織染色體異常的檢測，2009年 Menten[14]等將CGH與傳統細胞遺傳學技術結合流式細胞儀分析的100例自然流產組織和死胎標本中發現染色體異常核型為26例；2002年Stephenson[15]等用CGH 技術對285例反復流產患者，420例自然流產標本進行分析，發現染色體異常率為46%；2000年Fritz[16]等用CGH技術檢測了60例早期自然流產樣本，檢測出染色體異常率約為72%。

2.2 熒光定量QF－PCR在檢測染色體異常中的應用 熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF－PCR）技術是一種通過對短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）進行擴增，然后對染色體拷貝數目異常進行快速產前診斷的方法。最初應用于唐氏綜合征的快速產前診斷。后來經過優化和改良，目前已被廣泛應用于染色體異常的檢測，主要用于產前診斷中13三體、18三體、21三體的診斷；同時也應用于性染色體異常的診斷，如XO和XXY。

QF－PCR具有以下特點：①快速。QF－PCR技術應用了自動軟件分析儀器而使整個檢測過程僅需幾個小時便可完成，減少了患者焦慮的等待時間；②QF－PCR在鑒別母源性污染時比傳統核型分析技術和FISH更具有優勢。③其實驗過程可實現自動化，對多個樣本可同時進行批量檢測，操作簡單方便，適用于大批量、大規模的檢測；④所需的標本量少、結果可靠。可多個位點對引物進行同步擴增，結果并不互相影響；⑤費用低，不需要特殊儀器更加經濟。但是也有其自身的的缺點，如為了防止擴增片段中加入不必要的染色體部分，則需要找到更多的位點進行復合擴增，具有一定的難度。目前因為試劑盒的種類有限，QF－PCR技術還需要探索和完善。

在診斷染色體異常方面QF－PCR技術具有十分廣闊的發展空間。Cirigliano等[17]利用 QF－PCR對43000例臨床樣本進行檢測，結果顯示凡涉及到21、18、13、X和Y染色體的非整倍體100%被檢測出，一部分三體和嵌合體也被檢測出，95%的臨床相關異常被迅速檢出以及異常妊娠可以及時終止而不用等核型分析的結果。Sellmidt等[18]使熒光定量QF－PCR與STR結合應用，檢測了662例患者的13，18，21，X，Y號染色體，檢測出12個樣本常染色體數目異常，6個樣本的性染色體異常，21和13的染色體均有易位及在一例樣本檢測中沒有發現嵌合體，檢測的結果和核型分析的結果相同，驗證了這種方法應用于產前診斷常見染色體的非整倍體的準確可行性。最近Liao[19]等發現QF－PCR技術也可以用于檢測表型不明顯的染色體異常，這個發現又將產前診斷的發展向前推進了一步。

2.3 多重連接探針擴增技術在檢測染色體異常中的應用 多重連接探針擴增（multiplex ligation－dependent probe amplification，MLPA）技術是于2002年被Schouten等首次提出的，是結合分子雜交、連接和PCR半定量的新技術。于一次單一反應管內可同時檢測40個核苷酸序列拷貝數的變化，具有高通量、高分辨率以及成本低等優點。目前被廣泛應用于多個領域、多種疾病的研究。

MLPA技術具有高度的特異性，目前已針對容易發生畸變的熱點基因如18、13、21、X、Y染色體設計了特殊的探針，可以通過觀察基因數目的變化而判斷染色體的異常。該技術還可以利用探針信號的異常檢測出染色體三體型，部分嵌合體和染色體結構畸變。在自然流產樣本染色體的分析中，它能檢測已知區域的微小缺失、重復或突變，補充了傳統細胞遺傳學分析中的不足。MLPA作為核型分析的補充手段之一，具有高效、特異性高、方便快捷、價格低廉等特點。國內外均有研究將該技術用于胎兒、新生兒及流產組織的非整倍體檢測[20－22]。

綜上所述，隨著現代分子細胞生物學技術的不斷發展，尤其是快速產前診斷技術和自然流產染色體檢測技術等領域提供了巨大的發展空間。但是目前每種技術并不完美，存在自身局限性和缺陷，這也給其在臨床中的廣泛應用帶來一定的困難。省時、簡便、快捷、價格便宜的診斷方法是我們共同努力去實現的目標，相信隨著分子生物學技術和細胞遺傳學技術的不斷創新和進步，新技術新方法的不斷涌現，將會為我國優生優育做出重要的貢獻。

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