核糖核苷酸還原酶小亞基M2在腫瘤中表達及意義的研究進展

王兆永，劉佰純，田曉豐，池 琦，魏麗娟，王春田，曹 宏＊

核糖核苷酸還原酶小亞基M2在腫瘤中表達及意義的研究進展

王兆永1，劉佰純1，田曉豐2，池 琦1，魏麗娟1，王春田1，曹 宏2＊

（1．吉林大學第二醫院，吉林長春130041；2．吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

核糖核苷酸還原酶（Ribonucleotide Reductase．RR）在DNA合成、修復及細胞增殖中起關鍵作用，近來被認為是癌癥治療的重要靶點。RR包含3個亞單位，分別是大亞基RRM1、小亞基RRM2和小亞基p53R2。RRM2亞基不僅和DNA的合成密切相關，對惡性腫瘤生物學行為、轉移潛能和腫瘤耐藥的產生都具有影響．在絨癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌等多種人體癌組織中發現RRM2的表達水平有異常升高的情況，抑制RRM2的高表達，可以降低RR酶的活性，抑制癌細胞的生長，增加腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤轉移和逆轉耐藥。針對RRM2在腫瘤中高表達的抗腫瘤藥物主要有：3－AP、吉西他濱、RRM2的小干擾RNA、RRM2反義寡核苷酸及RRM2的反義cDNA，通過對RRM2的深入研究將有助于在基因水平及分子水平上揭示腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移的機制，為腫瘤的治療提供一個新的策略。

1 RRM2的結構和功能

腫瘤的形成和生長均與細胞的生長相關，而細胞的分裂、增殖及分化有賴于DNA的合成，核糖核苷酸還原酶（RR）存在于所有的生物細胞中，它是唯一催化核糖核苷酸轉化為脫氧核糖核苷酸的酶，它能夠將核糖核苷酸的5＇－二磷酸催化轉化成2＇－脫氧核糖核苷酸，而脫氧核糖核苷酸是DNA合成和修復的原材料，因此RR是DNA合成和修復通路中的限速酶［1－3］。在核苷酸代謝過程中發揮核心作用，對細胞的分裂、增殖及分化具有重要作用。根據金屬輔助因子不同，RR可分為三類，而基于序列同源性和別構調節機制，第I類又可進一步分為la，lb，和Ic三個亞類，人、鼠和大腸桿菌等的RR屬于la亞類。RR全酶結構包括大亞基α和小亞基β，形成α2β2的異四聚體結構后方具備活性。現已鑒定出人的RR全酶由一個大亞基Ml（RRM1）和一個小亞基（RRM2或P53R2）組成［4］。大亞基RRM1包括底物和變構效應物位點，且含有直接供給電子的琉基，控制著底物的特異性及酶活性的開／關，是腫瘤抑制基因，也是吉西他濱（Gemcitabine）的分子靶點。RRM2基因位于人染色體2p25→p24，全長10．3kb［1，5］，它是一個同源二聚體，由8個長螺旋結構互相折疊形成，其內包含兩個相同的二價鐵核心和一個酪氨酰自由基，這些對催化過程中觸發電子運輸非常必要，通過酪氨酸殘基的苯環形成特異的自由基而參加催化反應，其具有攜帶接觸抑制區，控制底物轉化的功能［6］。研究表明，RRM2除參與DNA合成外，對惡性腫瘤生物學行為、轉移潛能和腫瘤耐藥的產生都具有影響［7］。日本研究人員于2000年首先克隆出RR的另一個小亞基P53R2，它的基因在結構上和RRM2有80%以上的一致性［4，8，9］。當DNA損傷后P53R2可取代RRM2，與RRM1形成RR全酶，為DNA合成提供dNTPs，并進一步修復DNA［10］。

2 RRM2在腫瘤中的表達及意義

有研究應用傳統的免疫組化方法，首次在妊娠滋養細胞疾病（GTD）中檢測出了RRM2的表達部位和表達水平。近年來鄭州大學第二附屬醫院崔金全教授用免疫組化、免疫印跡和反轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）方法，即從mRNA和蛋白水平證明RRM2在葡萄胎和絨癌細胞中存在高表達。Mark S等［11］使用小干擾RNA（small interfering RNA，即siRNA）介導的RNA干擾，通過抑制胰腺癌細胞中RRM2表達，增強吉西他濱誘導的細胞毒性，同時構建了胰腺癌的原位移植瘤模型，通過全身給藥抑制腫瘤的RRM2表達，結果表明RRM2的siRNA與吉西他濱的有協同作用，顯著抑制腫瘤的生長，增加腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤轉移。他們研究證實了腫瘤細胞中RRM2的表達對吉西他濱化療耐藥至關重要，并首次證明了以siRNA全身給藥為基礎的治療，可增強核苷類抗癌藥的療效；另有研究表明在胰腺癌（尤其是不能手術的胰腺癌）患者中，RRM2的表達也起著關鍵的預測作用［12］；最近藤田等［13］的研究表明，對手術切除的胰腺癌患者檢測RRM2mRNA的表達水平，如其表達水平較低，則可提示這類患者使用吉西他濱化療有效；Fisher［14］從一個前瞻性數據庫中隨機選擇95例在2000年1月至2008年10月之間接受了胰十二指腸切除術胰腺癌患者的腫瘤標本，并對腫瘤樣本中RRM1，RRM2進行免疫組化分析，最終得出結論：RRM1表達與總生存期（OS）無關，腫瘤中RRM2的高表達與胰腺癌切除后無復發生存率（RFS）和總生存期（OS）減少相關，這些生物標志物可能有助于個性化的輔助治療。但是xie等［15］的研究似乎得出了與之相矛盾的結果，他們的研究小組對117例接受了腫瘤切除手術的胰腺癌患者的腫瘤標本構建腫瘤組織芯片，同時采用免疫組織化學方法測定RRM2蛋白表達量，并分組進行陰性、陽性對照，采用Kaplan－Meier法估計總生存期（OS）和無進展生存期（PFS），采用Cox比例風險模型研究RRM2表達價值，最終得出結論：在胰腺癌組織中的RRM2蛋白表達既不能判斷可切除胰腺癌患者預后，也不能預測這些患者輔助吉西他濱治療是否獲益。Morikawa等［16］對117例膀胱標本的組織芯片進行RRM2免疫染色。觀察14例非腫瘤性膀胱上皮，均未見RRM2染色陽性；4例低級別膀胱上皮癌（UC）也未見RRM2染色陽性；83例高級別膀胱上皮癌（UC）中，69例RRM2染色陽性，其中3例鱗狀細胞癌RRM2染色均呈陽性，伴有淋巴結轉移的13例膀胱上皮癌（UC）中，12例RRM2染色陽性。在進行了根治性切除術膀胱癌患者患者中，RRM2過度表達與肌層浸潤顯著相關。對15例異型反應的膀胱炎及25例原位膀胱癌的小的活體標本進行RRM2免疫組織化學染色，結果在15例異性反應膀胱炎標本中1例RRM2染色陽性（6．7%），在25例原位膀胱癌標本中24例RRM2染色陽性（96%）。他們的研究結果表明，RRM2蛋白頻繁的過度表達可能在膀胱癌中發揮作用，它將是一種新型的膀胱癌的診斷標志物和潛在的治療靶點。Morikawa［17］研究小組同樣對胃癌進行了研究，他們選取了114例胃癌標本，應用RRM2單克隆抗體和組織芯片進行免疫組織化學分析來確定RRM2蛋白表達情況，并對RRM2的表達與臨床病理因素之間的相關性進行統計學分析。再利用RRM2小干擾RNA轉染3個胃癌細胞系，MKN－1，MKN－7和SNU－719（分別為低分化，分化良好和Epstein－Barr病毒相關GC），用MTT法檢測其對細胞生長的影響。結果：檢測114例胃癌標本中52例RRM2蛋白表達，而在正常胃小凹上皮RRM2不表達，RRM2的表達與肌層浸潤，血管侵犯，淋巴結轉移呈正相關。應用小分子干擾RNA抑制RRM2表達，結果表明在所有這3個的胃癌細胞系的細胞生長均減少。Morikawa研究表明RRM2蛋白表達與胃癌惡性潛能有關，它在胃癌細胞的生長發揮了重要作用，RRM2可以作為一種新穎的診斷／預后的標記物和治療胃癌的一個潛在的治療靶分子。為了進一步研究RRM2和結直腸癌（大腸癌）的相關性，Liu等［18］將結腸癌的臨床研究結果同RRM2的表達聯系起來，他們收集了437例結直腸癌標本進行回顧性的研究，其中217例來自美國希望之城？？國家醫學中心（COH），220例來自浙江大學。他們應用免疫組化（IHC）來確定的RRM2蛋白表達水平，用實時定量PCR來驗證。通過siRNA下調RRM2表達水平顯著并特異的抑制細胞的生長，也降低了HT－29和HCT－8細胞的粘附能力。結果表明RRM2是預測大腸癌的一個獨立預后因素，也是一個潛在的判斷結直腸癌的化療反應好壞的預測指標。另一個來自中國上海微創外科中心（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院）研究小組研究了RRM2亞基在大腸癌中的作用及其在紫外線引起的DNA損傷修復中的作用。結果表明，RRM2過度表達與浸潤深度，低分化型，轉移階段呈正相關。RRM2過度表達可能與大腸癌的進展相關，通過siRNA使RRM2基因沉默，可以抑制大腸癌細胞的增殖和侵襲，RRM2在大腸癌的浸潤和轉移可能發揮重要作用，這是一個潛在的治療大腸癌的策略。研究人員得出一個結論，RRM2在大腸癌的發生和紫外線引起的DNA損傷修復中可能是一個促進因素。他們的研究表明，RRM2基因沉默抑制大腸癌細胞的增殖和侵襲，RRM2可能在大腸癌的浸潤和轉移中發揮了重要作用，抑制其功能可能是一個潛在的治療大腸癌的策略。也有研究表明，RRM2在乳腺癌和乳腺癌前病變中也存在的高表達，乳頭漿液性溢液涂片RRM2免疫組化染色可作為乳腺腺癌的鑒別手段［19］。最新的研究也表明RRM2在小細胞肺癌、膽管癌、上皮性卵巢癌組織中的表達均有不同程度的增多，因只少數報道，有待于進一步研究證實。

3 針對RRM2的抗腫瘤藥物研究現狀

RR抑制劑類是目前最有開發前景的抗腫瘤藥物之一［20］。抑制RR的機制主要有2點：①直接滅活RRM2亞單位的酪氨酞自由基。②通過離子絡合作用對RRM2亞單位的離子中心發生不可逆性抑制作用。3－氨基吡啶－2－甲醛硫代縮氨基脲（3－AP）是目前最有效的RR抑制劑，對多種人類及小鼠腫瘤均有顯著療效，并能增加順鉑、環磷酞胺等抗腫瘤藥物的活性，但對其毒理作用機制，尤其對生殖毒性和遺傳毒性研究，尚不夠全面系統。吉西他濱（Gemcitabine）是另一種核苷酸還原酶抑制劑，主要作用于腫瘤細胞的DNA合成期，即細胞周期的S期，在一定的條件下，可以阻止Gl期向S期的進展。目前臨床主要用于治療局部進展性或轉移性小細胞肺癌和不能手術的晚期胰腺癌等。近年來siRNA抗癌治療已成為研究的熱點，關于RRM2的siRNA研究也越來越多。眾多的實驗證明小分子干擾RNA（siRNA）可以增加胰腺腺癌對吉西他濱的敏感性，并減輕腫瘤細胞的侵襲性。據報道利用具有高效轉染反義核苷酸功能的最新脂質體將寡核苷酸轉染至腫瘤細胞內，明顯抑制了細胞生長，降低了RRM2蛋白、mRNA的表達。研究證實，RRM2反義寡核苷酸及RRM2的反義cDNA能顯著減少可誘導系統中RRM2蛋白的表達，降低酶活性，抑制癌細胞生長，逆轉耐藥［21］。就在今年八月美國食品藥品管理局（FDA）批準美國國家癌癥研究院（NCI）可以對Lorus公司先導化合反義藥物－GTI－2040與羅氏的希羅達（Xeloda），即卡培他濱（Capecitabine）進行治療轉移性乳癌的Ⅱ期臨床試驗。這是FDA所批準由Lorus和NCI合作進行的第二項臨床試驗計劃。第一次的試驗計劃是將GTI－2040與阿糖胞苷合用治療急性髓性白血病，目前在美國還有一個關于GTI－2040治療腎臟癌的Ⅱ期臨床正在進行中。也有報道將RRM2抑制劑和siRNA技術結合起來對其進行體內和體外抑制腫瘤細胞增殖的研究［22］。腫瘤組織尤其是高危和晚期患者RRM2高表達，可能會影響藥物治療效果，增加治療失敗的可能性。對高危和復發患者選擇抑制RRM2基因蛋白表達和RRM2酶活性的藥物，將有助于提高患者的治療效果。

目前腫瘤主要治療手段仍然是手術、放療和化療，雖然綜合治療較以往提高了患者的生存率，但有些腫瘤發現即為晚期，失去手術機會，放療及化療存在著盲目性，此外化療的耐藥也是臨床醫生及患者必須面臨的重要問題。近年來，隨著基因組學及分子生物學的飛速發展，腫瘤基因靶向治療作為一個新型的治療策略，它具有準確錨釘腫瘤部位，在局部保持相對高濃度，對正常組織細胞作用較小的特點，已經成為腫瘤治療的一個熱點。實驗證明在多種腫瘤細胞中RRM2的表達水平明顯高于正常細胞，它可用來預測某些腫瘤化療的療效，也可作為某些腫瘤的新型的診斷標志物及潛在的治療靶點。利用RRM2的siRNA、反義寡核苷酸和反義cDNA能夠抑制某些腫瘤中RRM2的表達，能夠抑制這些腫瘤細胞的生長逆轉某些化療藥的腫瘤耐藥性。我們有理由相信，通過對RRM2的深入研究將有助于在基因水平及分子水平上揭示腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移的機制，為腫瘤的治療提供一個新的策略。

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王兆永（1979－），碩士研究生，臨床醫師，主要研究方向肝膽腫瘤臨床與基礎研究。

2013－02－27）

本刊來稿中參考文獻編寫存在的主要問題

1007－4287（2014）02－0341－04

＊通訊作者

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