孕婦外周血中游離胎兒DNA富集與分離方法及在無創性產前診斷中的應用

楊麒巍，于 杉 綜述，張桂珍審校

（吉林大學中日聯誼醫院中心實驗室，吉林 長春130033）

在我國，每年新生兒出生缺陷多達80萬至120萬，盡早進行產檢篩查和診斷是最有效的應對措施，然而目前常規的診斷方法皆為有創性方法，對胎兒和孕婦都有一定的危險性，因此發展新的無創性產前診斷具有重要的臨床意義。1997年Lo等[1]發現在孕婦血漿中存在著少量的游離胎兒DNA（Cellfree fetal DNA，cffDNA），為無創性產前診斷方法提供了新的途徑。孕婦從懷孕第7周開始即可檢測到cffDNA，在最初3個月內cffDNA含量每周增加約21%，在隨后的3個月進入平臺期，在分娩前又迅速增加，分娩后2小時內迅速消失。cffDNA的這一特點使其可以早期、特異地進行產前篩查和診斷，且不易受到以往妊娠的干擾，由此可見，孕婦血漿中的cffDNA是進行無創性產前診斷的理想材料。目前，cffDNA已經應用于胎兒性別鑒定、常染色體遺傳病如β地中海貧血、軟骨發育不全、RhD血型鑒定、非整倍體遺傳病如21（18／13）－三體綜合征等、性染色體連鎖性疾病如X染色體連鎖的血友病、脆性X綜合征等遺傳性疾病的無創性產前診斷中。

然而孕婦外周血中cffDNA含量極少，僅為血漿總游離DNA的19%左右，并且與大量的母體血漿游離DNA混雜在一起，給cffDNA的檢測和分析造成了極大的困難，如何從孕婦外周血中高效富集cffDNA已經成為研究的焦點。目前，根據cffDNA分子與母體血漿游離DNA的差異分離cffDNA的方法主要可以歸納為cffDNA高效富集法和cffDNA特異性分離法，本文將對于以上幾種方法與其相關研究以及在無創性產前診斷中的應用進行簡要概述。

1 cffDNA高效富集法

1.1 凝膠電泳法

2004年，Chan等[2]發現，血漿中大多數cffDNA分子片段長度小于313bp，而大多數母體DNA分子片段長度大于313bp，根據這一重要特點，可以依據DNA分子片段長度的差異，特異性富集片段長度小于300bp的DNA分子，從而達到高效富集cffDNA的目的。

將DNA分子按照片段長度分開，最簡單有效的方法就是凝膠電泳法。Li等[3]利用從孕婦血漿中提取到的游離DNA進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，然后參照DNA分子量標準分別切取DNA分子量為90－23，000bp等部位的凝膠，并回收其中的DNA片段，利用實時PCR（real－time PCR）方法測定其回收的DNA含量及來源。該實驗首次利用瓊脂糖凝膠電泳的方法分離出孕婦血漿中游離的小片段DNA，并且進一步證明了Chan等[2]關于孕婦血漿中cffDNA片段大多小于300bp，而母體游離DNA片段大多大于300bp這一結論，同時證明了大片段游離DNA（例如＞20kb）中不含有cffDNA。利用瓊脂糖凝膠電泳富集cffDNA雖然存在分離不精確、回收效率低、容易引入外源性污染等缺點，但是可以有效地降低母體游離DNA背景的干擾。

此后，研究者們分別結合不同的檢測方法，支持了利用瓊脂糖凝膠電泳分離孕婦血漿中小片段DNA的可行性。Jorgez等[4]利用凝膠電泳法分離孕婦血漿中10－2，000bp長度的DNA片段，并對其進行全基因組擴增（Whole Gene Amplification，WGA），首次證明了凝膠電泳法分離的cffDNA可以通過WGA進行擴增富集，從而獲得足夠量的cffDNA用于進一步的基因檢測。Li等[5]在Ding等[6]關于應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix－assisted laser desorption／ionization timeof－flight mass spectrometry，MALDI－TOF MS）技術研究孕婦血漿中總游離DNA單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的基礎上，應用凝膠電泳富集后的cffDNA進行MALDI－TOF MS，極大地提高了 MALDI－TOF MS的靈敏度，同時基于此方法優化了單等位基因位點延伸反應（Single allele base extension reaction，SABER），克服了應用孕婦血漿總游離DNA進行SABER或同質質量延伸（homogenous MassEXTEND，hME）檢測時靈敏度低導致無法檢出的難題，極大地提高了利用cffDNA檢測SNP位點的靈敏度，并且應用此方法成功進行了兩例軟骨發育不全嬰兒的產前診斷，在軟骨發育不全胎兒的cffDNA中檢測到G1138A基因的突變，同時證明了應用經過尺寸分選后的小片段cffDNA與不經過尺寸分選方法比較，診斷的靈敏度和特異性顯著提高，這一研究結果為單基因點突變的無創性產前診斷提供了新的方法，但是應用這種方法的成本十分昂貴，并不適用于大規模的臨床推廣以及普通實驗室的應用。Li等[7]利用real－time PCR－肽核酸鉗制（Peptide－Nucleic－Acid Clamp）技術結合電泳富集cffDNA，應用序列特異性實時熒光定量PCR（Allele－Specific Real－Time PCR）檢測IVSI－1，IVSI－6，IVSI－110 以 及codon 39等基因的點突變，進行β－珠蛋白生成障礙性貧血的無創性產前診斷，采用較為簡單的方法，降低了檢測的成本，并且有利于利用cffDNA進行無創性產前診斷面向臨床的推廣。

除了上述方法之外，為了提高DNA分離的準確性、效率以及減少外源性污染，研究者們也在不斷嘗試應用一些基于電泳原理的更有效的方法，例如毛細管電泳[8]、陰離子交換高性能液體色譜（anion exchange HPLC）[9]、凝膠過濾純化柱[10]、等速電泳（Isotachophoresis，ITP）[11]等方法，進行cffDNA 的分離，同時結合實時熒光定量PCR（Real－time quantitative PCR，Real－time qPCR）技術檢測SNP位點，從而進行胎兒性別鑒定、常染色體遺傳病胎兒血型鑒定等多種無創性產前診斷。

1.2 磁性分離法

根據磁性納米微粒可以吸附DNA的原理，國內外已經開發出很多商品化的試劑盒，可以從血液或其他樣品中提取出痕量的DNA分子。瑞特等[12]通過優化磁性微粒吸附過程中反應體系的異丙醇及其他鹽離子濃度，控制磁珠特異性吸附孕婦血漿中的小片段DNA分子，從而達到高效富集cffDNA的作用，發明了一種利用磁性微粒法富集cffDNA的新方法?；诖判晕⒘Ｎ皆?，部分試劑公司已經生產出高效富集cffDNA的試劑盒，但仍無法完全去除樣品中的母體DNA干擾。目前，磁性分離法幾乎應用于cffDNA無創性產前診斷的所有領域。

1.3 甲醛預處理法

以往的研究認為，孕婦血漿中的母體DNA來自于凋亡的外周血細胞，基于這一理論，Dhallan等[13]將收集到的孕婦外周血用甲醛進行預處理，穩定細胞結構，防止外周血中細胞破壞，然后利用常規方法提取血漿中的總游離DNA，從而有效地減少母體DNA背景的干擾。應用PCR法進行13號染色體、21號染色體上SNP位點的擴增，通過計算拷貝數變化進行13／21號染色體數量異常的診斷，進而，應用這一技術成功進行了21－三體綜合征的無創性產前診斷[14]。遺憾的是雖然這一方法在發現初期得到了部分研究人員的驗證[15]，但是在此后重復性實驗中并沒有得到滿意的結果[16]。

2 cffDNA特異性分離法

2.1 甲基化DNA免疫沉淀法

2002年，Poon等[17]通過對比發現，母體血細胞內DNA甲基化水平與胎盤細胞內DNA甲基化水平存在某些差異，而這種差異可以用來區分母體游離DNA和cffDNA。隨后，Chim等[18]利用亞硫酸氫鹽測序法分別對母體血細胞DNA及胎盤細胞DNA內的18號染色體上的maspin基因甲基化水平進行比較研究，發現其在胎盤細胞內呈低甲基化狀態，而在母體血細胞內呈高甲基化狀態。Tong等[19]利用這一結論，聯合亞硫酸鹽預處理及甲基化特異性PCR方法，成功對18－三體綜合征進行了診斷。然而這種方法需要大量的初始cffDNA樣本，并且在檢測過程中破壞了cffDNA的結構，使檢測結果存在一定誤差，這些缺點阻礙了這種技術的發展和應用。

2009年，Papageorgiou等[20]利用甲基化 DNA免疫沉淀法（methylated DNA immunoprecipitation，MeDiP）聯合高通量寡核苷酸隊列分析技術，分別對于全血DNA和胎盤DNA的21、18、13、X和Y染色體進行了系統的比較，共發現2000多個甲基化差異區域（differentially methylated regions，DMRs），為非整倍體疾病的無創性產前診斷提供了大量的生物學標志資料。MeDiP是通過DNA甲基化位點特異性抗體與cffDNA中的高甲基化位點結合，將cffDNA中含有高甲基化狀態而母血游離DNA呈低甲基化狀態的區域特異性沉淀，從而在大量母體游離DNA中特異性分離出cffDNA。隨后，研究人員應用MeDiP分離孕婦血漿中cffDNA，并利用Real－time qPCR針對21號染色體上優選的12個DMRs進行擴增并計算其拷貝數的比值，通過21號染色體DMR與內參基因拷貝數比值的差異進行21號染色體非整倍體疾病的診斷，實驗結果表明，應用MeDiP結合qPCR技術進行多個DMRs的聯合檢測，并將擴增結果通過加權計算公式計算，可以準確的進行21－三體綜合征的診斷，其靈敏度和特異度均可達到100%，并可以進一步應用到13－三體綜合征、18－三體綜合征、X或Y染色體數量異常等非整倍體性遺傳病的無創性產前診斷[21]。MeDiP具有靈敏、準確、快速、簡單且節約成本等諸多優點，并且在懷孕早期即可進行診斷。

2.2 擴增測序法

Fan等[22]利用配對末端測序法（Paired－end sequencing），利用單堿基分解技術直接測量孕婦血漿中cffDNA的長度分布情況，并且可以直接選取小片段的DNA分子進行測序和分離，但是通過這種分子計數方法并沒有提高對于非整倍體遺傳病診斷的靈敏性。同時該課題組基于配對末端測序法開發了一種基于長度差異研究DNA分子特征的新方法[23]。

Lun等[24]在以往研究的基礎上，開發出一種數字化核酸尺寸選擇方法（digital nucleic acid size selection，digital NASS），Digital NASS是在數字PCR的基礎上，利用基因擴增原理，通過設置特定的雜交探針或擴增引物，特異性將共軛DNA中較短的DNA分子擴增，而較長片段的DNA分子則不能被擴增。Lun等用這種方法結合數字化相對突變劑量法（digital relative mutation dosage，digital RMD）和數字化相對染色體數量法（digital relative chromosome dosage，digital RCD），有效地提高了這兩種方法的檢出效率?？朔艘酝芯恐衃6]胎兒從母系遺傳的基因突變無法被檢測的限制。

2.3 微晶片法

Hahn等[25]設計了一種能夠從孕婦血漿中提取cffDNA的微型裝置，這個裝置是利用等速電泳技術（ITP）結合聚乙烯對苯二酰酯（polyethylene terephthalate，PET）膜和電動捕集（Electrokinetic trapping，EKT）技術原理制作的微晶片，可以達到高載量、自動化提取孕婦血漿中cffDNA的效果，并可以在低鹽的環境下進行DNA的富集，有效避免了高鹽條件對于后續PCR反應的影響，同時易于操作，成本較低，適用于臨床推廣。

孕婦血漿中cffDNA的發現為無創性產前診斷開辟了一條全新的途徑，然而cffDNA僅占血漿總游離DNA的4%－19%，并且尚未發現其特異性的遺傳標志物，大量的母體血漿游離DNA背景使得cffDNA的應用受到很大限制。目前針對cffDNA的研究，主要使用的仍是母體血漿總游離DNA，而分離cffDNA的方法又各有其優缺點（見表1）。因此，如果能發展一種更加特異、高效地從孕婦血漿總游離DNA中富集分離cffDNA的方法，則可以極大地提高利用cffDNA進行無創性產前診斷的特異性與敏感性，擴展適用范圍，促進其診斷技術的發展與臨床的推廣應用。

[1]Lo YM，Corbetta N，Chaberlain PF，et al.Presence of Fetal DNA in matermal plasma and serum[J].Lancet，1997，350（9076）：485.

[2]Chan KC，Zhang J，Hui AB，et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem，2004，50（1）：88.

[3]Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C，Kang A，et al.Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms[J].Clin Chem，2004，50：1002.

[4]Jorgez CJ，Bischoff FZ.Improving Enrichment of Circulating Fetal DNA for Genetic Testing Size Fractionation Followed by Whole Gene Amplification[J].Fetal Diagn Ther，2009，25：314.

[5]Li Y，Godelieve CMLP，Johan JPG et al.Non－invasive prenatal detection of achondroplasia in size－fractionated cell－free DNA by MALDI－TOF MS assay[J].Prenat Diagn，2007，27：11.

[6]Ding C，Chiu RW，Lau TK，et al.MS analysis of singlenucleotide differences in circulating nucleic acids：application to noninvasive prenatal diagnosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：10762.

[7]Li Y，Di Naro E，Vitucci A.Detection of paternally inherited fetal point mutations for beta－thalassemia using size－fractionated cellfree DNA in maternal plasma[J].JAMA，2005，293（7）：843.

[8]Griess GA，Serwer P.Improving the length－fractionation of DNA during capillary electrophoresis[J].Electrophoresis，2001，22（20）：4320.

[9]Yanakawa H，Higashino L，Ohara O.Sequence－dependent DNA separation by anion－exchange high－performance liquid chromatography[J].Anal Biochem，1996，240：242.

[10]Ritz W，Steinfelder HJ.Spin column assay to study apoptotic DNA fragmentation in 10（5）－10（6）adherently growing cells[J].Anal Biochem，2000，287：183.

[11]Chen L，Prest JE，Fielden PR et al.Miniaturised isotachophoresis analysis[J].Lab Chip，2006，6：474.

[12]恰根有限公司.分離核酸的方法：中國，200980120955.8[P].2009－05－12.

[13]Dhallan R，Au WC，Mattagajasingh S，et al.Methods to increase the percentage of free fetal DNA recovered from the maternal circulation[J].JAMA，2004，291：1114.

[14]Dhallan，R.A non－invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood：apreliminary study[J].Lancet，2007，369：474.

[15]Benachi A.Impact of formaldehyde on the in vitro proportion of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Clin Chem，2005，51：242.

[16]Chung，G.T.et al.Lack of dramatic enrichment of fetal DNA in maternal plasma by formaldehyde treatment[J].Clin Chem，2005，51：655.

[17]Poon LL，Leung TN，Lau TK，et al.Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem，2002，48：35.

[18]Chim SS，Tong YK，Chiu RW，et al.Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：14753.

[19]Tong YK，Ding C，Chiu RW，et al.Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma：theoretical and empirical considerations[J].Clin Chem，2006，52：2194.

[20]Papageorgiou EA，Fiegler H，Rakyan V，et al.Sites of differential DNA methylation between placenta and peripheral blood.Molecular markers for noninvasive prenatal diagnosis of aneuploidies[J].Am J Pathol，2009，174：1609.

[21]Papageorgiou1EA，Karagrigoriou A，Tsaliki E，et al.Fetal－specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21[J].Nat Med，2011，17（4）：510.

[22]Fan HC，Blumenfeld YJ，Chitkara U.Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell－free DNA by paired－end sequencing[J].Clin Chem，2010，56（8）：1279.

[23]Fan HC，Quake SR，inventors.Method of characterizing single DNA molecules based on length[J].US provisional patent application，2012，541.

[24]Lun FM，Tsui NB，Chan KC et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105：19920.

[25]Hahn T，Drese KS，O’Sullivan CK.Microsystem for isolation of fetal DNA from maternal plasma by preparative size separation[J].Clin Chem，2009，55（12）：2133.