MicroRNA－21在皮膚鱗狀細胞癌中的研究現狀

廣 維 尹新江 綜述 何春滌審校

·綜述·

MicroRNA－21在皮膚鱗狀細胞癌中的研究現狀

廣 維 尹新江 綜述 何春滌?審校

MicroRNAs是一類能夠調控真核細胞生物基因表達的小RNA，已被證實在多種腫瘤中表達失調。MiR－21是目前研究最為廣泛的microRNA，幾乎在所有實體腫瘤中高表達，最近發現在皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)中microRNA的表達也有異常。MiR－21通過調控靶基因改變腫瘤細胞侵襲作用，其靶基因主要包括PTEN、PDCD4、RECK等。本文主要介紹了MiR－21在皮膚鱗狀細胞癌中的研究現狀。

MiR－21； 皮膚鱗狀細胞癌； 靶基因； 發病機制

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為20～24個核苷酸(nt)的非編碼RNA分子,存在于多種生物的基因組中,通過mRNA剪切或抑制蛋白質翻譯發揮其轉錄后水平調控作用。研究表明miRNA在動植物生長發育、細胞增殖、凋亡和多種人類疾病的發生發展中起到重要作用,其表達模式在多種類型的腫瘤中發生了改變。1一部分miRNA被認定為抑癌基因,另一部分被認定為致癌基因(onco－miRs)。

MiR－21是研究最為廣泛的onco－miR,幾乎在所有實體腫瘤組織中異常表達,最近確定的皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)miRNA表達譜也揭示了其異常表達,2miR－21通過調控靶基因改變腫瘤細胞侵襲作用,其靶基因主要包括PTEN、PDCD4、RECK等。近年來關于miRNA在皮膚腫瘤中的研究日益增多,本文將對miR－21在皮膚鱗狀細胞癌中的研究現狀進行綜述。

1 MiR－21的生物學特征及功能

MiR－21位于17q23.2的FRA17B脆性區域上,具有自主轉錄單位。其轉錄首先在細胞核內由RNA聚合酶II介導生成pri－miR－21,再由Drosha酶加工成發夾狀pre－miR－21,最后被轉運至細胞質經Dicer酶剪切為成熟miR－21。1MiR－21在生物體內具有很強的保守性,在人體,前體miR－21 DNA位于l7號染色體重疊基因TMEM49的一個內含子上。MiR－21擁有獨立的啟動子,表達不受重疊蛋白編碼基因啟動子的調控,而其他多數miRNA與其重疊蛋白編碼基因共用一個啟動子。

MiR－21幾乎在所有上皮細胞來源的實體腫瘤中過度表達,包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、頭頸部腫瘤、食道癌,也在白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤等惡性血液病及膠質母細胞瘤、骨肉瘤、精原細胞瘤中過度表達。因此,miR－21幾乎是唯一一種在所有來源于上皮細胞、結締組織、造血細胞、生殖細胞或神經細胞的人類主要腫瘤中表達上調的基因,提示miR－21是一個非常重要的致癌基因。

功能抑制實驗證實miR－21幾乎涉及致癌過程的每一步:促進細胞增殖、侵襲、轉移,基因組不穩定和突變、炎癥、復制永生、代謝異常、生成血管、逃避細胞凋亡和免疫殺傷。其中,miR－21主要參與了細胞凋亡。Chan等3以反義寡核苷酸抑制miR－21表達,發現膠質母細胞瘤細胞明顯減少,caspase－3及caspase－7活性增加3倍,細胞凋亡明顯增加,證明miR－21參與了細胞凋亡,其異常表達抑制凋亡相關基因及蛋白的表達,進而促進惡性進展。

2 MiR－21的主要靶基因

每種miRNA都有上百種靶基因,每種mRNA又是不同miRNAs的靶基因,只有明確某種miRNA的mRNA靶基因,才能更深入研究其在腫瘤中的作用。1MiR－21在腫瘤中的表達通常上調,已報道的其靶基因多數是腫瘤抑制基因。目前已證實的miR－21靶基因包括28種,其中三分之二直接或間接參與內源性和/或外源性細胞凋亡途徑。4這表明,miR－21是一個在腫瘤細胞抵抗程序性死亡中起著關鍵的作用致癌基因,靶向細胞凋亡對表達miR－21的腫瘤是一種可行的治療方式。MiR－21通過調控靶基因PDCD4, PTEN,RECK等影響細胞增殖、凋亡和侵襲,5以下將著重闡述這3個基因。

2.1 PDCD4(Programmed Cell Death 4) 生物信息學分析證實,PDCD4位于miR－21靶定位點,通過與eIF4E結合調控腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、分化等過程。6,7在乳腺癌細胞中,miR－21通過刺激一種酪氨酸激酶受體Her2/neu表達上調,在Her2/neu陽性細胞中PDCD4表達下調。6在結腸癌細胞中,miR－21與PDCD4表達水平呈負相關,熒光素酶結構顯示miR－21過表達后直接作用于3'UTR,PDCD4啟動子活性下調,導致結腸癌細胞侵襲性增加。8此外,宮頸癌和膠質母細胞瘤細胞實驗已表明,miR－21直接靶點為PDCD4,從而導致其致癌特性。9,10Asangani等11的一項研究表明AP－1是一種轉錄因子,在Ras通路中誘導miR－21的表達。Ras通過這一途徑抑制PTEN和PDCD4。Aaron等12的研究表明PDCD4抑制翻譯起始和AP－1的活性,同時能夠降低皮膚乳頭狀細胞瘤發生及發展為鱗狀細胞癌的幾率。PDCD4也被證明在LPS誘導的細胞凋亡中起到調節作用。7LPS通路通過Toll樣受體4(TLR4)導致PDCD4表達增加,并通過IL－6和NF－κB誘導細胞凋亡,該過程依賴于PDCD4的表達。此外,NF－κB還誘導miR－21的表達,針對PDCD4形成負反饋,PDCD4以這種方式回應外來信號,誘導細胞凋亡。雖然LPS信號在腫瘤發生過程中不同于凋亡信號,但是PDCD4和miR－21為炎癥和腫瘤的發生提供了重要的聯系。

2.2 PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog) 是一種磷酸酶和腫瘤抑制基因,通過使磷酸肌醇－3－激酶(PI3K)去磷酸化而抑制Akt通路,13PI3K途徑活躍于多種腫瘤并且對細胞存活起調節作用。MiR－21介導PTEN表達已經在多種腫瘤細胞系中得到驗證。Meng等14的實驗表明,在肝癌細胞中當miR－21受到抑制時,PTEN基因的表達增加,腫瘤細胞增殖,遷移和侵襲能力均減弱。此外,miR－21轉染的非腫瘤細胞遷移增加。MiR－21通過3'UTR直接作用于靶基因PTEN。PTEN通過調節MMP－2和MMP－9參與細胞遷移和侵襲,MMP－2和MMP－9的活性同樣受到miR－21表達量的影響。Fak參與維持細胞活力和生存,其活性也受到PTEN和miR－21調節。

PTEN基因缺失和突變的小鼠容易誘導腫瘤。PTEN敲除小鼠的細胞增殖能力增強,抗凋亡,干細胞更新/維持,著絲粒不穩定,DNA雙鏈斷裂,15提高對致癌物質的敏感性和二次遺傳或表觀遺傳的改變,導致皮膚癌的發生。Suzuki等16利用Cre－loxP系統培育角質形成細胞PTEN基因敲除的突變小鼠(k5PTEN FLOX/FLOX小鼠)。所有突變小鼠在出生后8.5個月內自發生長腫瘤。k5PTEN FLOX/FLOX角質細胞過度增殖和抗凋亡,PTEN的下游信號傳導介質Akt/蛋白激酶B(PKB)和細胞外信號調節激酶活性增加。證實PTEN基因對皮膚正常發育和腫瘤發生具有重要調節作用。

PTEN種系突變與遺傳性腫瘤有關。然而,Pezzolesi等17發現無論胚系突變的狀態,癌癥表型主要受到miR－21調節的PTEN基因影響。總體來說,PTEN可以通過調控TNF－α信號通路作用于外源性凋亡,通過調控線粒體凋亡因子的表達作用于內源性凋亡。

2.3 RECK(Reversion－inducing cysteine－rich protein with Kazalmotifs) 是一種基質金屬蛋白酶抑制劑。通過抑制MMPs降解基底膜導致癌細胞轉移,從而在抑制腫瘤細胞浸潤、轉移及血管生成中起到重要作用。在轉錄后水平,RECK至少能夠調節3種基質金屬蛋白酶,其中MMP－2和MMP－9是腫瘤浸潤轉移過程中涉及到的關鍵蛋白水解酶。RECK可抑制pro－MMP(MMP－9的前體形式)的分泌,而膜錨定的RECK與可溶RECK聯合,并相互作用,既可抑制MMP－9,也可以抑制MMP－2、MMP－14的活性,從而抑制血管新生,誘導腫瘤細胞凋亡。18

RECK在經癌基因fos、ras、myc等轉染后均呈現不表達或低表達,說明RECK或許是癌基因共同作用負調節靶點,癌基因可造成RECK表達的下調。19MiR－21是目前研究最為廣泛的onco－miR,在胃癌細胞、膠質母細胞瘤、骨肉瘤和前列腺癌中已證實RECK為miR－21的靶基因,miR－21通過3｀－UTR區直接作用于RECK,二者表達量呈反比。20,21MiR－21通過增加MMPs促進腫瘤細胞轉移,因此抑制miR－21通過增加RECK的表達降低MMPs的活性,導致細胞運動和侵襲能力減弱。9此外,RECK的表達水平可用于多種常見腫瘤的預后評估,在腫瘤組織中RECK高表達的患者預后一般較無表達的好,RECK低表達常與腫瘤侵襲與不良預后相關。22,23

3 MiR－21與cSCC

cSCC是常見的皮膚癌,發病率僅次于皮膚基底細胞癌,在每年新發病的皮膚腫瘤患者中cSCC占10%以上。2460%的cSCC發生在頭頸部,多數皮損面積小,局限,經過手術治療容易控制,較大且侵襲性較強的皮損則需要多方面治療。14%頭頸部較大復發皮損的死亡率高達40%,然而關于cSCC發病的分子機制仍不明確。大量研究確定了一系列與cSCC發生發展有關的分子,如p53,cyclin D1,BRCA2,FAS, VEGF,Wnt－1,DEC1和microRNA,但是這些分子具體如何發揮調控作用尚不明確。

MicroRNA作為一種重要的能夠調控分化、侵襲、凋亡的非編碼RNA,在皮膚中的研究日益增多,這些研究主要集中在miRNA對皮膚形態發育和腫瘤形成的潛在作用。最近的研究結果證實miRNA參與毛囊形態生成(miRNA在表皮和毛囊差異表達),皮膚自身免疫性疾病,慢性炎癥性疾病(銀屑病,紅斑狼瘡, ITP),傷口愈合和皮膚腫瘤的發病。25

MiR－21作為一種致癌基因,已在多種腫瘤中被廣泛研究,包括非cSCC,口腔和食管的鱗狀細胞癌和喉癌,其在cSCC中的研究仍處于起步階段。Dziunycz等26首先基于實時反轉錄酶PCR分析,在免疫功能正常和接受器官移植的cSCC受試者中檢測了一組近年來被報道在角質形成細胞中具有功能的miRNA,包括miR－21,miR－184,miR－203和miR－205。發現與正常皮膚相比,cSCC的miR－21和miR－184表達顯著增加,miR－203表達顯著下降。UVA照射的皮膚角質已被證實導致miR－21過量表達,而UVB輻射對miR－21的表達幾乎沒有影響。27MiRNA表達譜的失調已在多種SCCs中被證實,近來cSCC的miRNA表達譜被Sand等2通過微陣列芯片掃描的確定,結果顯示18個miRNA表達下調,包括miR－21在內的13個miRNA表達上調。

Grhl3作為保守進化的Grainyhead轉錄因子,在調節表皮分化過程中發揮重要的調節作用,近年來在cSCC發病機制中被逐步研究。Bhandari等28研究發現Grhl3敲除小鼠表皮分化障礙、多向分化基因表達減少,分析其皮膚miRNA表達譜,確定了包括miR－21在內的11種miRNA差異表達,Grhl3表達下降后miR－21表達上調,進而導致cSCC發生。Darido等29進一步確定PTEN是Grhl3發揮抗腫瘤效應的關鍵下游基因。MiR－21癌基因網絡同時靶向作用于Grhl3和PTEN,放大PI3K/Akt/mTOR信號,誘導cSCC。此外,Grhl3/PTEN基因缺乏的cSCC對PI3K/Akt通路呈現易感性,同時伴有MAPK/ERK通路表達下調。

骨形態發生蛋白(BMPs)在控制皮膚的發育,組織重塑和腫瘤發生中發揮重要作用。Ahmed等30的實驗表明miR－21通過調節選擇性BMP靶基因(同時也是miR－21靶基因)的表達,參與BMP通路在角質形成細胞中發揮作用。雖然角質形成細胞中完整的miR－21靶基因表達譜還有待進一步研究,但有些基因(PTEN,PDCD4,TIMP－3和TPM－1)已確定作為腫瘤抑制基因同時受BMP4和miR－21的調節。PTEN, PDCD4,TIMP－3和TPM－1已被證明在miR－21作用下表達下調。6,9RECK和TIMP－3也被證實在肺鱗癌中表達下調,有證據表明在cSCC轉基因小鼠模型中PDCD4表達下調,舌SCC中miR－21介導TPM－1表達下調。27PTEN在皮膚中的表達缺失有助于腫瘤發展,16而表皮中PDCD4過表達將抑制腫瘤生長。12TIMP－3和TPM－1通過調節上皮－間質相互作用、抑制細胞運動和腫瘤侵襲,從而抑制腫瘤生長。4然而miR－21是否在cSCC中通過誘導PTEN,RECK,PDCD4,TIMP－3或TPM－1表達下調發揮致癌作用有待進一步研究確定。

化學刺激致小鼠皮膚癌模型是研究cSCC的重要方法,所使用試劑多為DMBA/TPA。Ma等31建立miR－21等位基因敲除的小鼠模型,并以DMBA/TPA刺激小鼠皮膚,發現與野生型小鼠相比,miR－21缺失的小鼠乳頭狀瘤的形成顯著減少,細胞凋亡增加,細胞增殖能力降低。此外,還發現在miR－21缺失的角質形成細胞中存在大量已驗證或預測的miR－21靶基因表達上調,而角質形成細胞正是皮膚乳頭狀瘤的前體細胞,cSCC同樣源于角質形成細胞的惡性增殖。當miR－21缺失后Spry1,PTEN,PDCD4上調,同時ERK,Akt,JNK磷酸化減少,這3種蛋白是活化后Ras的主要下游效應因子,在DMBA誘導的皮膚癌中發揮主導作用。這些結果證明miR－21通過負向調節靶基因減弱了Ras抑制腫瘤的三大旁路途徑效應,從而在體內發揮其致癌作用。

綜上所述,miR－21可能通過調節靶基因PTEN, RECK,PDCD4,TIMP－3或TPM－1等在cSCC發病中發揮重要作用,但是需要進一步研究證實。

4 展望

臨床研究證據顯示許多miRNA在多種腫瘤中表達上調或下調,某些miRNA表達水平與疾病的階段相關。現有研究表明,miR－21高表達與頭頸部SCC和消化系統腫瘤的總體生存率相關。32因此,miRNA可作為潛在的腫瘤診斷和預后的標志物。

此外,由于miRNA在癌癥和其他人類疾病中的關鍵作用,其用于靶向治療具有很大潛力。與miRNA序列互補的寡核苷酸體積小(19－24 nt),例如,miRNA拮抗劑,能有效地阻止miRNA在體內的功能,而miRNA模擬物可以提高miRNA的功能。現有的siRNAs體內傳輸策略可以方便地應用于miRNA拮抗劑和miRNA模擬物。這些進展為不久將來以miRNA為基礎藥物的開發奠定了基礎鋪平了道路。由于給藥途徑方便,預計皮膚相關疾病將最先應用以miRNA為基礎的藥物進行治療。MiR－21作為目前研究最為深入的miRNA,其表達可作為cSCC的一種潛在治療靶點,但是關于其信號轉導通路的了解仍處于早期階段。MiR－21的下游基因、基因網絡及上游因子都需要大量深入的研究來確定。

1Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function.Cell,2004,116(2):281－297.

2 Sand M,Skrygan M,Georgas D,et al.Microarray analysis of microRNA expression in cutaneous squamous cell carcinoma.J Dermatol Sci,2012,68(3):119－126.

3 Chan JA,Krichevsky AM,Kosik KS.MicroRNA－21 is an antiapototic factor in human glioblastoma cells.Cancer Res,2005,65 (14):6029－6033.

4 Buscaglia LE,Li Y.Apoptosis and the target genes ofm icroRNA－21.Chin ICancer,2011,30(6):371－380.

5 Liu C,Yu J,Yu S,et al.MicroRNA－21 acts as an oncomir through multiple targets in human hepatocellular carcinoma.J Hepatol,2010,53(1):98－107.

6 Zhu S,Wu H,Wu F,et al.MicroRNA－21 targets the tumor suppressor genes in invasion and metastasis.Cell Res,2008,18 (3):350－359.

7 Lu Z,Liu M,Stribinskis V,et al.MicroRNA－21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene,2008,27(31):4373－4379.

8Chen Y,Liu W,Chao T,et al.MicroRNA－21 down－regulates the expression of tumor suppressor PDCD4 in human glioblastoma cell T98G.Cancer Lett,2008,272(2):197－205.

9Gabriely G,Wurdinger T,Kesari S,et al.MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targetingmatrixmetalloproteinase regulators.Mol Cell Biol,2008,28(17):5369－5380.

10Yao Q,Xu H,Zhang QQ,et al.MicroRNA－21 promotes cell proliferation and down－regulates the expression of programmed cell death 4(PDCD4)in HeLa cervical carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):539－542.

11 Asangani IA,Rasheed SA,Nikolova DA,et al.MicroRNA－21 (miR－21)post－transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion,intravasation and metastasis in colorectal cancer.Oncogene,2008,27(15):2128－2136.

12 Aaron PJ,Corinne EC,Nancy HC.Epidermal expression of the translation inhibitor programmed cell death 4 suppresses tumorigenesis.Cancer Res,2005,65(14):6034－6041.

13Ma J,Sawai H,Ochi N,et al.PTEN regulates angiogenesis through PI3K/Akt/VEGF signaling pathway in human pancreatic cancer cells.Mol Cell Biochem,2009,331(1－2):161－171.

14Meng F,Henson R,Wehbe－Janek H,et al.MicroRNA－21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer.Gastroenterol,2007,133(2):647－658.

15He XC,Yin T,Grindley JC,et al.PTEN－deficient intestinal stem cells initiate intestinal polyposis.Nat Genet,2007,39(2): 189－198.

16 Suzuki A,Itami S,OhishiM,et al.Keratinocyte－specific pten deficiency results in epidermal hyperplasia,accelerated hair folliclemorphogenesis and tumor formation.Cancer Res,2003,63 (3):674－681.

17 PezzolesiMG,Platzer P,Waite KA,etal.Differential expression of PTEN－targetingmicroRNAsmiR－19a and miR－21 in cowden syndrome.Am JHum Genet,2008,82(5):1141－1149.

18 Correa TC,Brohem CA,Winnischofer SM,et al.Downregulation of the RECK－tumor and metastasis suppressor gene in glioma invasiveness.JCell Biochem,2006,99(1):156－167.

19 Chang HC,Liu LT,HungWC.Involvementofhistone deacetylation in ras－induced down－regulation of the metastasis suppressor RECK.Cell Signal,2004,16(6):675－679.

20Han L,Yue X,Zhou X,et al.MicroRNA－21 expression is regulated byβ－catenin/STAT3 pathway and promotes glioma cell invasion by direct targeting RECK.CNS Neurosci Ther, 2012,18(7):573－583.

21 Zhang Z,Li Z,Gao C,et al.MiR－21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression.Lab Invest,2008, 88(12):1358－1366.

22 Jung HM,Phillips BL,Patel RS,et al.Keratinization－associated miR－7 and miR－21 regulate tumor suppressor reversioninducing cysteine－rich protein with kazalmotifs(RECK)in oral cancer.JBiol Chem,2012,287(35):29261－29272.

23Stenzinger A,von Winterfeld M,Rabien A,et al.Reversioninducing cysteine－rich protein with kazalmotif(RECK)expression:an independent prognosticmarkerof survival in colorectal cancer.Hum Pathol,2012,43(8):1314－1321.

24 Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011: the impact of elim inating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths.CA Cancer JClin,2011,61(4): 212－236.

25 Yi R,O'Carroll D,Pasolli HA,et al.Morphogenesis in skin is governed by discrete sets of differentially expressedmicroRNAs. Nat Genet,2006,38(3):356－362.

26Dziunycz P,Iotzova－Weiss G,Eloranta JJ,et al.Squamous cell carcinoma of the skin shows a distinctmicroRNA profile modulated by UV radiation.J Invest Dermatol,2010,130(11): 2686－2689.

27 Hufbauer M,Lazi?D,Reinartz M,et al.Skin tumor formation in human papillomavirus 8 transgenic mice is associated with a deregulation of oncogenic miRNAs and their tumor suppressive targets.JDermatol Sci,2011,64(1):7－15.

28Bhandari A,Gordon W,Dizon D,et al.The grainyhead transcription factor Grhl3/Get1 suppressesmiR－21 expression and tumorigenesis in skin:modulation of themiR－21 target MSH2 by RNA－binding protein DND1.Oncogene,2012,3(168): 1038－1048.

29 Darido C,Georgy SR,Wilanowski T,et al.Targeting of the tumor suppressor GRHL3 by amiR－21－dependent proto－oncogenic network results in PTEN loss and tumorigenesis.Cancer Cell,2011,20(5):635－648.

30 Ahmed MI,Mardaryev AN,Lewis CJ,et al.MicroRNA－21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes.J Cell Sci,2011,124(Pt 20):3399－3404.

31Ma X,Kumar M,Choudhury SN,et al.Loss of themiR－21 allele elevates the expression of its targetgenes and reduces tumorigenesis.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(25):10144－10149.

32 Li J,Huang H,Sun L,et al.MiR－21 indicates poor prognosis in tongue squamous cell carcinomas as an apoptosis inhibitor. Clin Cancer Res,2009,15(12):3998－4008.

(收稿:2013－04－01)

An update ofm icroRNA－21 in cutaneous squamous cell carcinoma

GUANGWei,YIN Xin-jiang,HEChun-di.Department ofDermatology,The First Affiliated Hospital ofChina Medical University,Shenyang,110001

MicroRNAs are a class of small RNAs that are capable of regulating the expression of gene in eukaryotes.microRNAs have been shown to be dysregulated in the progression of various cancers.MiR－21 was identified to be strongly expressed inmany solid tumors.Them iRNA expression profilesof cSCC has been detected recently.It refered thatmiR－21 was overexpressed.It has been shown thatmiR－21 regulates tumor cells invasiveness by controlling target genes,which include PTEN,PDCD4,RECK et cetera.This paper introduces the research on the current state of relation between microRNA－21 and cutaneous squamous cell carcinoma.

MiR－21；cutaneous squamous cell carcinoma；target gene；pathogenesis

中國醫科大學附屬第一醫院皮膚科,沈陽,110001

?通信作者