PLGA納米顆粒作為基因遞送載體的研究進展

張瀚尹，梁高峰，2，韋 芳，閆 彬

（1河南科技大學醫學技術與工程學院，河南洛陽 471003；2東南大學醫學院，江蘇 南京 210009）

·綜述·

PLGA納米顆粒作為基因遞送載體的研究進展

張瀚尹1，梁高峰1，2，韋 芳1，閆 彬1

（1河南科技大學醫學技術與工程學院，河南洛陽 471003；2東南大學醫學院，江蘇 南京 210009）

尋找安全、高效的基因遞送載體一直是基因治療領域的研究熱點之一.本文對近年來 PLGA作為遞送載體及相關問題進行了綜述.首先簡述了 PLGA納米顆粒的性質及制備方法，然后對其作為遞送載體的研究概況進行了探討，最后指出了目前 PLGA作為遞送材料存在的問題，并對其前景進行了展望.

基因遞送；PLGA納米顆粒；基因

0 引言

目前，基因療法已經逐漸成為臨床治療中的一種重要手段，作為基因治療的一個關鍵環節，基因的遞送近年來備受關注.其方式有病毒載體法和非病毒載體法兩大類.病毒載體法轉染率高，使用范圍廣，但制備較復雜，有一定的毒性，可能產生免疫反應和排斥反應［1－2］.由于這些缺點，限制了其在生物醫學中的應用.非病毒載體法轉染率雖然不及病毒載體，但是其安全性高、毒性低、不易產生免疫反應和排斥反應，相對而言具有更大的優勢.基因遞送技術目前已成為生物醫學研究中一項重要且常用的技術，運用該技術可以進行外源基因的高效表達、蛋白結構與功能的研究以及生產目的蛋白；基因表達調控機制的研究，實現細胞的表型改變或轉化；基因治療與轉基因動物的研究；RNA干擾以及核酸類藥物的研究等.

理想的基因遞送載體應滿足以下幾個方面的要求［3］：①保護基因不被破壞和降解；②容易和靶細胞結合；③容易穿過細胞膜；④容易與基因解離；⑤載體本身容易被降解；⑥載體和降解后的產物對機體無毒副作用.

PLGA因其無毒、可降解、易于制備和功能化等方面的良好性能，成為一種較好的基因遞送材料［4－6］，PLGA即聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA），是由乳酸和羥基乙酸聚合成，它水解后的產物為乳酸和羥基乙酸，是一種生物相容性好、易生物降解且廣泛用于生物醫藥和生物工程的高分子材料［7－8］.人體正常代謝時也會產生這兩種物質，因此PLGA本身是無毒的，不會對機體造成毒副作用.根據實際應用和研究表明，小分子量的PLGA更適合作為基因遞送載體，本文主要介紹PLGA納米顆粒作為基因遞送載體的研究進展.

1 PLGA納米顆粒的制備方法

PLGA納米顆粒的制備方法有很多種，包括乳化溶劑 揮 發 法［9］、復 乳 化溶 劑 擴散 法［10］、噴霧 干 燥法［11］、復乳化溶劑揮發法［12］等.復乳化溶劑揮發法是最常用于制備基因片段包裹 PLGA的方法.而這些方法的選擇取決于所需要的顆粒直徑和包裹率.以聚合物為原料制備微球最常用的方法是先制備成O／W、W／O、W／O／W、O／W／O等型乳液后，再根據具體的用途選擇適當方法使液滴固化成微球.制備方法的選擇對顆粒直徑有很大的影響.此外，制備過程中，有機相與水相的比例、PLGA的性質、表面活化劑的選擇、pH值、攪拌的方式等均會對納米顆粒的粒徑產 生影 響［12－14］.

1.1 乳化溶劑揮發法 稱取一定量的 PLGA固體，溶解于丙酮溶液中，將所得 PLGA溶液用針頭以一定的流速滴加到1%吐溫 －80乳化劑水溶液中，同時以一定速度攪拌并超聲.完成并形成乳液后，于磁力攪拌器上攪拌，當有機溶劑完全揮發后得到納米粒混懸液.將所得納米粒混懸液于3 000 r／min低速離心，先除去大顆粒沉淀，再在10 000 r／min高速下冷凍離心1 h，用蒸餾水洗滌沉淀.將沉淀物超聲分散于50 mL蒸餾水中，真空冷凍干燥 24 h即可得到 PLGA納米顆粒.

1.2 復乳化溶劑擴散法 ①稱取30 mg的PLGA固體溶于2 mL二氯甲烷中，置于冰上；②量取2%的PVA水溶液 30 mL，置于冰上；③將溶液①冰浴超聲30 s，形成初級乳化液，隨后將初乳倒入到溶液②中以同樣的條件超聲2 min，得到復乳；④將復乳在通風櫥中，1 000 r／min置于恒溫磁力攪拌器上攪拌 3 h，充分揮發二氯甲烷；10 000 r／min，5 min，離心洗滌納米顆粒3次；將洗滌好的納米顆粒放入凍存管中真空凍干，保存于 －20℃備用.

1.3 噴霧干燥法 將 PLGA先制備成乳液后，用輸送泵把乳液從直徑約0.5 mm的噴嘴送出，在壓縮空氣流速為20 L／min，噴料速度 500 mL／h的流動條件下霧化，壓縮空氣將 PLGA霧化成極小的液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個腔體中，并利用吹入的120℃空氣瞬時加熱，使液滴瞬間除去大部分水分，液滴中的溶劑揮發，并通過廢氣管排出，干燥的 PLGA納米顆粒于收集瓶中收集.

1.4 復乳化溶劑揮發法 將一定量需制備的樣品溶于5%PEG水溶液中，將一定量 PLGA溶于二氯甲烷／丙酮（體積比3∶1）混合溶液中，再將樣品的PEG水溶液加入 PLGA溶液中超聲 1 min，形成 W／O型乳液，將該乳液加入一定濃度的PVA水溶液中，冰浴并以一半功率超聲10 min，形成復乳液.將該復乳液置于常溫下磁力攪拌 3 h，然后在4℃，20 000 r／min低溫高速離心20 min收集納米粒，使用蒸餾水洗滌納米粒三次，冷凍干燥48 h，可得到 PLGA納米顆粒.

2 作為遞送載體的研究

2.1 遞送小分子藥物 目前的藥物治療中，藥物的分子大小會影響到體內各種酶對其的降解作用，也會使其不能很好地參與到血液循環之中，因而不能發揮應有的療效.但如果采用一種靶向給藥系統，這就會使藥物定向地到達靶組織，從而更好地發揮藥效.許多研究表明，對于順鉑、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、姜黃素等小分子治療藥物，PLGA納米顆粒可以有效地包裹，并使其發揮更好的作用.Danhier等［15］以偶聯了具有腫瘤靶向性的 RGD分子（一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽）的 PLGA納米微球作為紫杉醇（PTX）的遞送載體，研究了它對小鼠腫瘤的生長抑制作用.結果表明，注射了RGD-PLGA-PTX的實驗組經過18天腫瘤直徑達18 mm，注射PLGA-PTX組用了12 d，而僅注射磷酸緩沖液的對照組只用了 7 d腫瘤直徑即達 18 mm.這些實驗說明 RGD-PLGAPTX在抑制腫瘤生長上具有顯著的效應.此外，我國學者李井泉等［16］在用 PLGA-5-Fu的進一步研究發現，隨著給藥劑量的增加，納米顆粒的抑制作用逐漸加強，呈劑量效應.這些研究均為 PLGA納米顆粒此后更廣泛地用于生物醫學領域遞送小分子藥物奠定了理論依據.

2.2 遞送 siRNA 目前某些基因異常相關的疾病，尤其是惡性腫瘤的基因治療日益成為臨床上研究的熱點.而在這一領域中，RNA干擾以其高效的序列特異性基因沉默技術而得到了廣泛關注［17］.作為潛在的治療藥物，其在抗病毒、抗腫瘤和神經系統疾病防治等方面具有巨大潛力［18－19］.但是，同很多生物大分子藥物一樣，低毒高效的遞送方式是 siRNA藥物進入臨床研究的關鍵環節，因此該技術的應用重點就轉化到了如何開發一種高效的遞送載體上.Park等［20］通過 PLGA納米顆粒包裹的 COX-2 siRNA和地塞米松實現了風濕性關節的有效治療，結果表明，PLGA納米粒子可幫助siRNA有效逃避溶酶體的降解作用，并且PLGA無免疫原性，不會引起機體的免疫排斥反應.Zhou等［21］采用偶聯特異性肽鏈的 PLGA包裹的 siRNA在動物體內實現了靶向肺部的高效siRNA的遞送，有效的延長了siRNA在體內的循環時間，提高了治療的效果.實驗結果證實，經過特異性抗體或受體修飾的 PLGA／siRNA體系具有更好的治療效果，而且用藥量更少，有望成為一種高效的腫瘤治療藥物.

2.3 遞送 pDNA 非病毒載體基因疫苗是指使用非病毒遞送載體將治療基因表達載體 質粒基因（plasmid DNA，pDNA）遞送入細胞內，從而使質粒調控基因表達，進而使表達產物發揮治療作用.Liang等［22］采用復乳化揮發法制備了攜帶miRNA表達載體的PLGA納米顆粒，該納米粒子具有較高的基因轉染效率、較低的細胞毒性，在HePG2細胞中獲得了較高的miRNA的表達，有效的抑制了HepG2細胞周期的進程.在當前藥劑學的研究課題中，將裸 DNA直接注入病變組織，而不依賴于其他物質的參與，這一方法固然簡便，無毒無害，但由于裸 DNA直接暴露于血清之中，易受到各種酶的作用，因此轉染效率低，作用不穩定.這樣，尋找一種高效的基因載體就顯得極為重要.PLGA納米顆粒可運載不同大小的基因片段，可以抵抗核酸酶的降解作用，從而延緩基因降解，并且還能以內吞、融合、脂交換等多種作用方式進入細胞，這就使得PLGA納米顆粒在 pDNA的導入中具有極大的應用空間，同時，PLGA納米顆粒載體還克服了病毒載體的安全性問題，這一點至關重要.

2.4 體內應用研究 PLGA納米顆粒作為一種非病毒載體，相較病毒載體更有優勢，因其安全、可持續性釋放及良好的生物相容性、可降解性、穩定性等生物學特性，被認為是一種更有前景的基因遞送載體.目前在臨床醫學研究方面已有廣泛應用，包括疫苗、組織修復、抗腫瘤等，特別在腫瘤治療中展現出巨大潛力.對于抗腫瘤研究，孫國臣［23］合成 BCNU-PLGA納米顆粒，用于觀察其對大鼠腦C6質瘤的治療作用，結果發現該藥物表現出顯著的抗腫瘤增值、侵襲和抗血管生成作用.劉杰等［24］用體外培養的肝癌細胞系HepG2的細胞分別與采用特殊工藝方法制備的阿霉素PLGA納米顆粒（ADM-PLGA-NP）及ADM原藥共同培養一段時間，以研究 ADM原藥和載藥納米顆粒（ADM-PLGA-NP）在治療肝癌上的差異.結果顯ADM-PLGA-NP在細胞內具有更強的 ADM藥物分子熒光強度，且穩定性好，易于被 HepG2細胞吞噬攝取，從而使ADM能從納米顆粒中緩慢釋放出來，已達到長期給藥的目的，從而更有效地抑制肝癌細胞的生長.

另外，在很多動物實驗研究中，發現PLGA在神經再生、血管修復、治療壓力性尿失禁、骨愈合、局部麻醉、防輻射等方面也有顯著作用.田洪居等［25］通過向小鼠坐骨神經旁注射羅哌卡因PLGA納米顆粒（ROP-PLGA-MS），以研究該納米顆粒的局麻效果.結果顯示小鼠在羅哌卡因 PLGA微球坐骨神經旁植入后3 h，給藥側肢體開始出現明顯的感覺阻滯效果，較對照側對熱傷害刺激的反應明顯遲鈍，10～18 h達到藥效高峰，30 h起藥效開始減退；48 h后藥效接近消退，神經阻滯時間約30 h.結果發現ROP-PLGAMS納米顆粒能有效延長羅哌卡因時效，且血藥濃度低，毒性小.這對臨床局麻藥物研究方面產生了深遠影響.孫偉光等［26］制成氨磷汀納米顆粒用于防輻射，該納米顆粒能對各個組織器官實行有效的防護，大大降低了輻射造成的損傷.氨磷汀納米顆粒制劑解決了一直以來氨磷汀類藥物口服無效的問題，在防輻射方面具有較好發展前景.孫陽等［27］自制 s-PLGA，通過兔子實驗，研究其對兔肝癌的成像效果，結果表明該納米顆粒能有效增強兔肝臟腫瘤與正常組織間的信號強度對比，對肝癌的早期診斷和治療具有重要臨床意義.此外，在組織工程方面，Kim等［28］將SOX9基因通過 PLGA納米粒子遞送至人骨髓間充質干細胞內，有效的增強了SOX9基因的表達，顯著提高了間充質干細胞在體內形成軟骨的能力，開辟了干細胞應用于臨床治療的新途徑.

3 問題與展望

病毒感染法雖然具有很高的轉染效率，但存在潛在、未知的危險性，使其應用受到諸多限制.因此，在基因遞送載體和方法的研究中，人們越來越重視非病毒載體和方法的開發與優化.大量的實驗研究證實：作為良好的基因遞送載體，PLGA納米顆粒為基因治療開創了一條全新的途徑，特別是作為藥物載體與靶向技術的聯合運用，在今后必將成為醫藥界學者研究的熱點.現在國外已有 PLGA納米顆粒上市，國內也正在進行這類生物載體的相關研究，但是還存在著一些瓶頸，例如遞送的效率、靶向性、安全性等.這些問題都需要生物醫學研究者和臨床醫師們不斷進行深入的研究，并予以解決.

此外，不僅僅是作為遞送載體，在組織工程方面，PLGA還可以用于細胞的生長支架，為細胞的增殖提供三維空間和新陳代謝的微環境，并可以決定新生組織的大小、器官的大小和形狀.而 PLGA的無免疫原性、組織相容性好和無毒可降解的特性，在體外能夠支持細胞的生長、引導體內組織生長、幫助生物活性分子轉導以及其組成和結構可以通過剪裁來適應特殊的需要，從而可以提高細胞的生長效率.

當然，基于 PLGA的眾多特殊性質，還可以用于皮膚移植，傷口縫合，體內植入等方面，而更多的應用領域還有待于進一步拓展和研究.相信隨著科學技術的不斷發展，經過不斷改性和特異性表面修飾的PLGA納米顆粒將會越來越完善，并在科學研究和臨床治療中發揮更大的作用.

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Advance research on PLGA nanoparticles as gene delivery carriers

ZHANG Han-Yin1，LIANG Gao-Feng1，2，WEI Fang1，YAN Bin11School of Medical Technology and Engineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2Medical School，Southeast University，Nanjing 210009，China

To explore safe and efficient gene delivery carriers is of the hot topic in the field of gene therapy.In this paper，research progress on PLGA nanoparticles as gene delivery carriers in the recent years were reviewed.We described the present research status in PLGA nanoparticles and their preparation method.Discussion in-depth for the application of PLGA nanoparticles in biomedical research was also given in the article.Meanwhile，problems existing in PLGA nanoparticles as a delivery carriers were pointed out while its prospect was also proposed.

gene delivery；PLGA nanoparticles；gene therapy

Q782

A

2095-6894（2014）06-155-04

2014-09-18；接受日期：2014-09-30

國家自然科學基金（U1404824）；河南科技大學博士啟動基金（09001635）；河南科技大學青年科學基金（2013QN44）；河南科技大學SRTP項目（2012214）

張瀚尹.在讀碩士.E-mail：drf1000＠163.com

梁高峰.博士，副教授.E-mail：lgfeng990448＠163.com