依達(dá)拉奉對(duì)帕金森病大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用及黑質(zhì)紋狀體丙二醛和一氧化氮水平的影響

劉書(shū)芳

河南省漯河市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南漯河 462000

帕金森病（PD）是當(dāng)前醫(yī)療研究的熱點(diǎn)之一[1]。氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致帕金森病的主要機(jī)制[2]。因此，保護(hù)機(jī)體神經(jīng)組織并且盡量的防止氧化應(yīng)激反應(yīng)是帕金森病治療的關(guān)鍵[3]。依達(dá)拉奉作為一種有效的抗氧化劑[4]，近年來(lái)我校以PD大鼠為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉對(duì)PD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用和黑質(zhì)紋狀體MDA、NO有一定的影響。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器

成年健康雄性SD大鼠72只，體重（250±20）g，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)。抗壞血酸、阿撲嗎啡、抗絡(luò)氨酸羥化酶抗體、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、6-羥基多巴胺（上述材料均由美國(guó)Sigma公司提供）；SABC試劑盒（北京中杉金橋公司提供）；丙二醛試劑盒、一氧化氮試劑盒（南京建成公司提供）；依達(dá)拉奉（先聲東元公司提供）；BX50WI倒置顯微鏡（日本Olympus公司提供），MICRO4動(dòng)物腦立體定位儀（美國(guó)WPI公司提供）。研究時(shí)間為2014年3月—2014年5月。

1.2 模型制作與動(dòng)物分組

1.2.1 模型制作 選擇60只大鼠制作PD模型。腹腔麻醉，固定在動(dòng)物腦立體定位儀，沿中線切開(kāi)2 cm切口，暴露前囟，確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束位置和鉆顱部位。鉆開(kāi)直徑2 mm顱骨孔，微量進(jìn)樣器進(jìn)針至靶點(diǎn)。約10 min后，注入6-羥基多巴胺4μL，濃度為2μg/μL，速度為9 ng/s。注射完成后留針10 min，然后退針。明膠海綿堵塞顱骨孔，青霉素常規(guī)消毒、縫合皮膚，然后放回籠中。

1.2.2 動(dòng)物分組 12只大鼠為健康正常組（ZC），不作任何處理。12只大鼠為生理鹽水組（YS），在PD模型制作完成30 min后，腹腔注射生理鹽水1 mL，2次/d，連續(xù)14 d。另48只PD大鼠為實(shí)驗(yàn)組，在PD模型制作完成30 min后腹腔注射依達(dá)拉奉，濃度分別為0.3、1、3、3 mg/kg，記 0.3 mg 組、1 mg 組、3 mgA 組、3 mgB組。除 3 mgB組外，每日注射2次，持續(xù)14 d；3 mgB組持續(xù)28 d。

1.3 評(píng)價(jià)方法

1.3.1 旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) ZC、YS、0.3g、1g、3gA 組在處理 14d、3gB 組在處理28d后腹腔注射阿撲嗎啡，標(biāo)準(zhǔn)為0.5mg/kg。注射5min后持續(xù)記錄30min。如PD模型大鼠在30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于210次，為制模成功。如制模不成功，重復(fù)1.2制模和分組過(guò)程。

1.3.2 組織學(xué)方法 復(fù)合麻醉劑深度麻醉后，快速灌注生理鹽水沖洗，然后快速灌注200 mL 4%甲醛，再緩慢灌注300 mL甲醛。斷頭取腦，置于4%甲醛，4℃冰箱固定4 h。然后依次置入20%、30%蔗糖磷酸鹽緩沖液，4℃冰箱直至腦塊沉入瓶底。取紋狀體、中腦組織行冠狀連續(xù)冰塊切片，作尼氏體染色，計(jì)算黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 神經(jīng)生化學(xué)檢測(cè) 在大鼠斷頭后，快速取出大腦，分離出紋狀體和中腦黑質(zhì)，4℃生理鹽水沖洗，濾紙拭干，置于-80℃超低溫冰箱。稱重后，剪碎組織塊，置于冰浴玻璃勻漿器勻漿。然后按照丙二醛、一氧化氮試劑盒操作要求，測(cè)定丙二醛和一氧化氮活性變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。LSD法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理對(duì)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)與黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞的影響

各處理對(duì)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)與黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)的影響見(jiàn)表1。0.3mg、1mg、3mgA、3mgB 組旋轉(zhuǎn)次數(shù)顯著低于 YS組，但是高于ZC組（P<0.05）。各處理右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。ZC組左側(cè)尼氏體細(xì)胞數(shù)最高，其次為3mgA和3mgB組，YS、0.3mg、1mg組左側(cè)尼氏體細(xì)胞數(shù)最少。

表1 各處理對(duì)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)與黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)的影響

2.2 各處理對(duì)丙二醛和一氧化氮含量的影響

各處理對(duì)丙二醛和一氧化氮含量的影響見(jiàn)表2。黑質(zhì)與紋狀體中的一氧化氮和丙二醛含量均呈同一規(guī)律變化，ZC組的丙二醛含量與一氧化氮含量顯著低于其他各組（P<0.05）。3 mgA組和3 mgB組則顯著低于 YS、0.3mg和 1mg組（P<0.05）。

表2 各處理對(duì)丙二醛和一氧化氮含量的影響

3 討論

氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致帕金森病的主要原因[5]。目前多巴胺是治療帕金森病的主要藥物。但是長(zhǎng)期服用將會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)波動(dòng)、精神癥狀等，而且療效將會(huì)減退[6]。因此，急需尋找一種替代藥物。依達(dá)拉奉可以轉(zhuǎn)移電子，打破脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)也可以抑制氧化型細(xì)胞損害，防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。另外，依達(dá)拉奉的親脂基團(tuán)還可以清除羥自由基，抑制過(guò)氧化作用。從本研究的結(jié)果來(lái)看，依達(dá)拉奉可以減少誘發(fā)后的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。尤其是隨著處理濃度的增大，旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯降低。在本研究中，3mgA組、3mgB組30min旋轉(zhuǎn)次數(shù)分別為 （210.13±9.56）、（206.42±8.81）次，顯著少于 YS組、0.3mg組和 1mg組。上述結(jié)果揭示了依達(dá)拉奉可以改善PD大鼠的行為。本研究結(jié)果與成亞琴,陳鑫,張?jiān)碌萚6]結(jié)論是一致的。在他們的報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)3mg/Kg處理可以有效的減輕大鼠旋轉(zhuǎn)。他們認(rèn)為這可能與DA神經(jīng)元丟失減少、延緩了PD發(fā)展有關(guān)。從黑質(zhì)體內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)來(lái)看，各組右側(cè)尼氏體細(xì)胞數(shù)并無(wú)明顯差異，但是3mgA組和3mgB組左側(cè)尼氏體細(xì)胞數(shù)顯著少于ZC組，多于YS組和0.3mg組、1mg組，這揭示了左側(cè)尼氏體細(xì)胞數(shù)對(duì)PD大鼠行為具有一定的保護(hù)作用。依達(dá)拉奉則可以提升PD大鼠左側(cè)尼氏體細(xì)胞數(shù)。

一氧化氮和丙二醛被認(rèn)為是過(guò)氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物。從本研究的結(jié)果來(lái)看，注射依達(dá)拉奉后，雖然一氧化氮和丙二醛含量依然高于正常組（ZC），表明大鼠依然存在異常的過(guò)氧化作用，但是注射依達(dá)拉奉大鼠（3mg）的一氧化氮和丙二醛含量明顯低于未注射依達(dá)拉奉大鼠（YS組）。不過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉注射量抑制過(guò)氧化作用的效果存在差異。高劑量（3mg/kg）組的抑制效果顯著好于低劑量組（0.3mg/kg、1mg/kg）。該結(jié)果表明了依達(dá)拉奉的使用劑量與過(guò)氧化抑制效果存在相關(guān)性。隨著依達(dá)拉奉使用量增高，過(guò)氧化抑制效果越好。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[5]、文獻(xiàn)[6]的報(bào)道結(jié)論是一致的。在文獻(xiàn)5、文獻(xiàn)6的報(bào)道中，認(rèn)為依達(dá)拉奉具有較強(qiáng)的氧化過(guò)激反應(yīng)抑制作用。抑制氧化過(guò)激反應(yīng)則是治療PD的主要原則之一。

綜合而言，對(duì)PD大鼠注射依達(dá)拉奉，可以較好的保護(hù)神經(jīng)，改善大鼠行為，抑制一氧化氮和丙二醛生成，防止機(jī)體過(guò)氧化作用，揭示了依達(dá)拉奉在帕金森病的治療中具有重要的價(jià)值。但是本研究結(jié)論是基于大鼠實(shí)驗(yàn)，目前有關(guān)于人體試驗(yàn)的報(bào)道尚未見(jiàn)到。依達(dá)拉奉是否對(duì)PD患者具有效果、具體的劑量、使用方法等都還是空白。這需要在以后進(jìn)一步深入。

[1]熊珮,陳忻,張楠.帕金森病病理機(jī)制及中藥防治帕金森病實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(5):686-691.

[2]張美蓉,孫芳玲,艾厚喜,等.帕金森病的炎癥及抗炎藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(11):1040-1043.

[3]陳鑫,成亞琴,施建生,等.依達(dá)拉奉對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病大鼠黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].江蘇醫(yī)藥,2013,39(7):779-782.

[4]黃月,趙青贊,任秀花,等.依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的PD大鼠模型神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2011,28(1):53-54.

[5]吳二兵,陳鑫,張?jiān)?等.依達(dá)拉奉對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病大鼠黑質(zhì)紋狀體MDA、NO含量的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2013,30(9):781-784.

[6]成亞琴,陳鑫,張?jiān)?等.依達(dá)拉奉對(duì)帕金森病大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用及黑質(zhì)紋狀體丙二醛和一氧化氮水平的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2013,26(4):282-285.