黑素瘤相關MicroRNAs的研究進展

吳 飛宋寧靜

黑素瘤相關MicroRNAs的研究進展

吳 飛1宋寧靜2?

近年來發現MicroRNAs可通過膜受體酪氨酸蛋白激酶通路、PI3K－AKT通路、P16INK4ACDK4/6－RB通路、小眼相關轉錄因子、p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路影響黑素瘤的生物學行為,MicroRNAs及其靶基因相關通路的研究對黑素瘤的早期診斷、預后判斷以及黑素瘤的靶向治療具有重要的意義。

黑素瘤； MicroRNAS； 靶基因； 信號通路

1 M icroRNAs

MicroRNAs是一類內源性、非編碼、高度保守的小RNA,主要作用是通過與mRNA的相互作用調節特定基因的表達水平。在胚胎早期發育、細胞增殖和分化、細胞凋亡以及多種腫瘤的發生和發展等一系列重要的生命過程中都有廣泛的影響。有學者推測,人類基因組所有基因的表達可能都直接或間接受到MicroRNAs的調節。

與mRNA一樣,MicroRNAs主要由RNA聚合酶II轉錄剪接修飾,最初產物為Pri－miRNA,長度約300～1000個堿基,局部有莖環結構。首先在核內被Drosha RNase切成含有莖環結構的Pre－miRNA,長度約70個堿基。轉移至細胞質中后,被Dicer酶切成含有20～24對堿基的RNA雙鏈結構。雙鏈解旋后,其中一條為成熟MicroRNAs,另一條為其互補鏈。成熟MicroRNAs可與RNA誘導的基因沉默復合物(RNA－induce silencing complex,RISC)結合,形成非對稱RISC復合物(asymmetric RISC assemble)。此復合物可通過非嚴格堿基配對原則與目標基因3'端非編碼區結合,形成一種MicroRNA－mRNA鏈,從而阻止mRNA的翻譯,在基因水平影響蛋白的合成。1MicroRNAs參與調控基因表達的機制與siRNA介導的mRNA降解不同,其表達有其嚴謹的位相性和時相性,在不同組織、不同發育階段表達都有顯著差異。成熟MicroRNAs互補鏈產生后一般會被立即水解,少部分會長期存在,并有與MicroRNAs相似的作用。

2 M icroRNAs與黑素瘤

黑素瘤發病的過程有明顯的步驟:異型黑素細胞首先在局部不典型增生；隨后出現放射性生長和垂直性生長形成局部侵襲的原發性黑素瘤；隨著腫瘤細胞進一步向真皮侵襲和播散,血管淋巴管形成,腫瘤向遠處轉移。長期以來學者對于這一轉變過程的發生機制進行了大量的研究,近年來相關MicroRNAs對于黑素瘤增殖、侵襲、轉移的影響引起了廣泛的重視。

Stark對一系列黑素瘤細胞系MicroRNAs表達譜進行了分析,發現目前已知的MicroRNAs中有279種與黑素瘤的各種生物學行為有直接或間接的關系。2然而由于MicroRNAs結構特殊,而且其以一種不完全互補的方式與靶基因結合,導致靶基因難以確定,故其中大部分異常MicroRNAs目前尚無明確意義。此外,由于樣本量小,許多研究結論缺乏說服力,各個研究之間的標準不一,也難以進行橫向比較。黑素瘤相關MicroRNAs的研究尚不成熟,目前研究主要為以下幾條通路:

2.1 膜受體酪氨酸蛋白激酶通路(RAS－RAF－MEKERK) 此通路RAS被各種生長因子(如:干細胞因子、纖維生長因子、肝細胞生長因子等)激活后,可介導RAF的聚集,通過磷酸化作用依次激活絲裂原激活蛋白酶激酶的激酶(MEK)和細胞外信號調節激酶(ERK)。ERK在黑色素痣中有促細胞有絲分裂的作用。RAS在原發性黑素瘤中突變率為15%～30%,利用RNA干擾技術減少RAS可以降低細胞內ERK水平,并能促進腫瘤細胞凋亡。3后續研究發現RAS是let－7a的靶基因,后者具有抑制RAS表達的作用,可抑制黑素瘤細胞的增殖和侵襲。4此外,活化的ERK可上調整合素β3的表達,促進癌基因的轉錄。RAF、MEK和ERK均是RAS的下游基因,RAF在黑素瘤中變異率可達50%～70%,其主要變異類型為BRAFV600E,且RAF變異一般不與RAS變異同時發生,故此通路相關的總變異率可達到80%～90%。此外,cKIT基因也可激活此通路,Godshalk認為該激活因素在肢端型和黏膜型黑素瘤亞型中有較強致癌作用。5cKIT是miR－221的靶基因,后者是最早發現的與黑素瘤相關性較大的MicroRNAs之一,Kanemaru運用qRT－PCR對94例黑素瘤患者和20名健康者血清miR－221水平進行檢測,發現兩者具有明顯的差異,并與腫瘤侵犯程度相關,認為其可作為一種可靠的黑素瘤診斷標記物；在原位黑素瘤手術切除后miR－221水平降低,這提示miR－221還可作為一種治療療效和預后評估的指標。6miR－221/222也可調節cKIT,還可影響細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑P27的表達,P27對細胞的增殖、凋亡具有調節作用,在黑色素腫瘤由良性向惡性的轉變過程中P27表達逐漸消失。7在黑素瘤的發展過程中,當miR－221/222過度表達時,cKIT和p27水平下調。Igoucheva也證實抑制cKIT和p27可使黑素瘤細胞的增殖能力增強。8Mattia還提出ETS－1/miR－222調節軸,即致癌基因ETS－1受到miR－222的調節在轉移性黑素瘤中轉錄性激活miR－221/222,而在痣細胞痣或原位黑素瘤卻抑制miR－221/222的表達。9此外miR－214還可通過抑制轉錄因子AP－2γ(Transcription Factor AP－2 gamma,TFAP2C)間接激活cKIT。10

2.2 PI3K－AKT通路 此通路在大多數轉移性黑素瘤中被激活,PI3K被生長因子激活后轉變為血清PIP2進一步轉化為PIP3,后者可激發AKT磷酸化下游蛋白,從而調控細胞的增殖和凋亡。目前發現僅有miR－125b水平與AKT3呈負相關,可能為miR－125b的靶基因。11在原發性黑素瘤中miR－125b的大幅度下調與腫瘤的早期轉移有關,并與前哨淋巴結陽性率有關。12

2.3 P16INK4A－CDK4/6－RB通路 黑素細胞的凋亡衰老常伴有P16INK4A水平的上升。在大多數散發的黑素瘤和30%家族性黑素瘤中P16INK4A會因沉默或變異而鈍化。P16可抑制細胞周期蛋白D依賴性激酶(cyclin－D－dependent kinases)CDK4和CDK6,而后兩者是維持腫瘤抑制物視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,RB)活性的重要物質。P16INK4A的失活會導致細胞周期蛋白D依賴性激酶的超常活化,通過磷酸化作用使E2F轉錄因子從RB上分離,從而上調細胞的增殖能力。let－7b通過抑制細胞周期蛋白D1、D3、CDK4和細胞周期蛋白A阻滯細胞周期進程。let－7b在原發性黑素瘤中明顯下調。13通過對黑素瘤MicroRNA表達譜的分析發現miR－193b的表達明顯低于良性痣細胞痣,高表達的轉移性黑素瘤細胞系的增殖和生長的G1期明顯被抑制,miR－193b的靶基因為細胞周期蛋白D1,后者是影響細胞周期的主要因素,在包括黑素瘤在內的多種腫瘤中普遍高表達。14miR－205在轉移性黑素瘤中的表達明顯低于原位黑素瘤和良性痣細胞痣,而重新轉染后,可抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。研究證實miR－205的靶基因為轉錄因子E2F1。15,16

2.4 小眼相關轉錄因子(Microphthalmia－associated Transcription Factor,MITF) MITF在細胞的增殖、分化、瘤變中起重要作用。對于細胞外凋亡信號的整合極為重要。MITF可對Dicer基因進行調節,Dicer酶是MicroRNAs形成的關鍵酶,參與RNA誘導的基因沉默復合物的形成,所以與黑素瘤相關的MicroRNAs都與之相關,對于黑色素細胞的分化、增殖、凋亡和細胞周期有廣泛的影響。17有學者認為MITF的水平直接決定色素細胞的發展和最終歸宿。在轉移性黑素瘤中MITF表達水平上調,并與生存率相關。18最近研究表明MITF對于黑素細胞的調節呈雙向性,其表達水平過高或過低都會促進黑素瘤的發生發展。19此外, MITF是最主要的黑素生成轉錄因子,其功能與細胞內POU3F2基因的表達水平有關。20

由于MITF的這種特性,以其為靶基因的MicroRNAs不能被簡單地認為促癌或抑癌作用,MITF的3'非編碼區可與miR－137、miR－148/152和miR－124/ 506等許多MicroRNAs的“種子區域”結合。21Goswami還發現MITF還含有另一個較短的3'非編碼區, miR－340可以結合這兩個非編碼區,其作用是維持MITF含量的穩定。22miR－137被認為是調節MITF表達水平的主要因素之一,其表達與MITF呈負相關。23研究表明,在直腸癌中miR－137也具有雙重調節作用:既可以抑制腫瘤細胞的生長,又在淋巴結轉移的直腸癌中高水平表達。24,25此外,MITF的另一種調節基因miR－506在早期黑素瘤中上調,但在轉移性黑素瘤標本中卻下調。21MiR－182的靶基因也是MITF,在黑素瘤由原位向轉移性發展的過程中伴隨著該miRNA的明顯上調。當該基因受到抑制時腫瘤細胞的侵襲性下降,凋亡增加,反之轉移性增加。26Mueller還發現miR－148在黑素瘤侵襲性生長過程中會明顯下調,27對MITF也有重要的調節作用。Mazar認為MITF對miR－211有調節作用,后者在大多數黑素瘤細胞系和標本中都明顯下調,與黑素瘤的發展和侵襲有關。其在黑素瘤和痣細胞痣中表達存在顯著差異,可能與黑素瘤的成瘤有關。28相對于良性痣細胞痣miR－155在黑素瘤細胞系中下調,miR－155的表達可抑制黑素瘤增殖,增加細胞凋亡,進一步研究發現miR－155的靶基因為SKI。29后者是MITF的強效誘導物,在黑素瘤中常過度表達,有刺激細胞增殖和促進腫瘤轉移的作用。30

2.5 p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路 在研究黑素瘤細胞系miR－149－3p的含量時,發現6組野生型p53陽性黑素瘤細胞系miR－149－3p的含量均上調,而另一組p53基因沉默的ME4405細胞株卻沒有這一現象。31這說明p53有直接上調miR－149－3p的作用,進一步研究發現miR－149－3p與GSK3a的下調和Mcl－1的上調有直接的關系。32而Mcl－1被認為是黑素瘤細胞凋亡的關鍵因素。33由此p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路可能影響黑素瘤細胞凋亡。

以上通路之間存在相互聯系和作用,一種MicroRNAs也可在多條通路中發揮作用。也有數種MicroRNAs共同調節某一蛋白表達,其中機制尚待進一步研究。

3 結語

近年來,黑素瘤的死亡率較為穩定,甚至出現了輕度下降,其重要原因為對于該病的早期診斷和手術水平提高,在T1(≤1.00 mm)10年生存率達92%,而T4(＞4.00 mm)僅為50%。34WHO黑素瘤分型主要依據臨床表現,然而黑素瘤包含著大量生物學的改變,在體內有眾多的信號通路控制其發生發展,根據其生物學行為及信號通路影響特點尋求有意義的生物學標記和治療靶點將成為黑素瘤治療的新理念。因此建立一套生物學分型十分必要,在這種分型中MicroRNAs是可能性最大的潛在標志。2007年Gaur等根據當時已知的241種MicroRNAs區分了多種良惡性腫瘤及其亞型,發現3種MicroRNAs(miR－146, miR－204 and miR－211)在黑素瘤中異常表達。35由于MicroRNAs在不同臨床類型和各個病程階段中都有顯著特點,每一型黑素瘤都有自身的MicroRNAs表達譜,找出亞型特異性MicroRNAs及其靶基因對黑素瘤的早期診斷和個體化治療有重要意義。36

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(收稿:2013－04－16 修回:2013－08－04)

M icroRNAs in melanoma

WU Fei,SONGNing-jing.Shanghai Skin Disease Hospital,Shanghai,200443

MicroRNAs can affectmelanoma biology through multiple signaling pathways(RAS－RAF－MEK－ERK,PI3K－AKT,P16INK4A－CDK4/6－RB,MITF,p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1).Researches on MicroRNAs are of significance in early diagnosis,prognostic judgment and target therapies ofmelanoma.

melanoma；MicroRNAs；target gene；signaling pathways

1安徽醫科大學上海皮膚性病臨床學院,上海,200443

2上海市皮膚病醫院,上海,200443

?通信作者