大孔樹脂在甘草活性成分分離純化中的應用△

程新宇，韓亞男，金燕清，李紅麗，侯俊玲*，王文全

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102)

國家“重大新藥創制”科技重大專項( 2009ZX09308-002)，國家中醫藥管理局行業專項( 201107009-03)

*

侯俊玲，教授，博士生導師，研究方向：中藥材質量評價，E-mail：mshjl@126.com ；王文全，教授，博士生導師，研究方向：中藥材質量評價及其產品開發，Email：wwq57@126.com

大孔樹脂在甘草活性成分分離純化中的應用△

程新宇1，韓亞男1，金燕清1，李紅麗1，侯俊玲1*，王文全2，3*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102)

甘草為我國常用藥材，其活性成分的分離純化一直是研究的熱點。本文主要介紹大孔樹脂在分離純化甘草皂苷類成分、甘草黃酮類成分及甘草多糖中的應用，并提出相關研究建議：加強大孔樹脂分離純化除甘草酸以外的甘草活性成分的研究；不同類的活性成分通過一個大孔樹脂柱完成分離；大孔樹脂法與其他分離純化方法聯用方面的研究；建立相關的樹脂分離純化工藝模型的，進而指導工業化生產。

甘草；活性成分；大孔樹脂；分離純化

大孔樹脂(macroporoue resins)是一種不溶于酸、堿及各種有機溶劑的新型高分子材料，發展于20世紀70年代，國外早期應用于廢水處理、醫藥工業、化學工業等。我國主要將其用于中草藥化學成分的分離純化[1]。大孔樹脂既有相似相容的吸附作用，又有分子篩作用，對不同的有機物吸附力不同，進而可被一定的洗脫劑分離，達到分離純化的目的[2]。大孔樹脂還具有物理化學穩定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、節省費用等諸多優點[3]。因而其在中草藥的分離純化中的應用越來越廣泛，如銀杏葉總黃酮醇苷[4]、知母皂苷A3[5]、大黃蒽醌類成分[6]、淫羊藿黃酮[7]及三七葉抗抑郁組分[8]的分離和純化。

甘草是甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥功能[9]。現代藥理研究發現，甘草具有抗炎、保肝、抗病毒、鎮咳、抗菌、抗氧化、抗瘧、抗癌、免疫調節、降糖和抗血小板凝集等活性[10]，其活性的主要物質基礎為甘草總皂苷、甘草總黃酮、甘草酸及甘草苷等[11]。本文主要歸納和總結近年來科研工作者采用大孔樹脂對甘草活性成分進行分離純化的研究，為大孔樹脂在中草藥分離純化中的應用提供一定的參考依據。

1 分離純化甘草皂苷類成分

1.1 甘草總皂苷

甘草總皂苷為三萜皂苷類物質，是甘草的標志性成分，從3種不同來源的甘草中已發現20余種皂苷，存在形式多為葡萄糖苷，易溶于水，其苷元多為齊墩果烷型三萜類[12]。甘草總皂苷具有多種生物活性，研究發現其具有抗潰瘍、消炎、抗病毒、抗癌活性[13-14]，在日本將甘草總皂苷用于慢性乙肝臨床治療已經有20多年的歷史[15]。

因甘草總皂苷具有良好的活性，近些年來不斷有關于將大孔樹脂法用于甘草總皂苷分離純化的研究報道。龔行楚等[16]認為通過篩選樹脂類型，優化工藝參數，利用大孔樹脂法分離純化皂苷可以達到高產、優質的良好效果。李躍輝等[17]以大孔樹脂對甘草總皂苷的吸附率、洗脫率、比吸附量、比洗脫量為考察指標，測定了AB-8、D-101、DM-301型大孔樹脂，并考察吸附、純化等工藝參數，結果發現D-101大孔吸附樹脂適宜于甘草總皂苷的分離純化，其最佳上樣條件：上樣液濃度為5 mg·mL-1(甘草總皂苷含量)，pH為7，上樣流速為2 BV·h-1(BV樹脂床體積)；最佳洗脫提取條件：先用2 BV水除雜，再用4 BV、pH為8.0～9.0的50%乙醇以2 BV·h-1的速度進行解吸附，可較好制備甘草總皂苷。朱中佳等[18]通過對HPD100、HPD300、HPD700、HPD722、D-101型5種樹脂篩選，發現HPD300樹脂適宜純化甘草總皂苷。優選出純化工藝：生藥濃度為0.2 g·mL-1的上樣液，5 BV上樣，以6 BV的50%乙醇洗脫并收集濃縮揮干，制備所得的甘草干浸膏中總皂苷含量可達55.6%，甘草酸含量可達27.2%，且此工藝簡單環保，較適合大工業生產。袁懷波等[19]對比6種大孔樹脂吸附純化甘草總三萜酸的性能，發現AB-8樹脂較其他5種樹脂較優。對AB-8樹脂進一步考察發現，上樣液pH為5時其吸附甘草總皂苷能力較優，當洗脫劑為70%乙醇溶液時，產品中總皂苷純度可達72.85%。高雪巖等[20]采用HPD400型大孔樹脂，以30%乙醇溶液除雜，50%乙醇溶液洗脫得到總皂苷部分，經藥理學驗證表明，所得部分對CCI4致小鼠急性肝損傷和DL乙硫氨酸致小鼠急性脂肪肝具有一定的保護作用。說明利用大孔樹脂富集純化后的總皂苷部位有較好的活性，在預防和治療各類肝病和保肝方面值得進一步研究和開發。

1.2 甘草酸

甘草酸(glycyrrhizic acid)是甘草皂苷類成分之一，是甘草的主要活性物質。其分子結構包括1分子甘草次酸及2分子葡萄糖醛酸，有2種立體異構體，分別是18α和18β[21]。現代研究發現甘草酸具有多種藥理活性，如抗病毒作用、抗炎保肝活性、抗腫瘤作用、解毒作用。甘草酸及其鹽還有抗痙攣作用、神經保護作用、與其他藥物協同抗哮喘作用及抗結核作用等[22]。因此，如何大量地從甘草中制備甘草酸成為研究關注的焦點，其中不乏關于利用大孔樹脂法制備甘草酸的研究。

郭永誼等[23]利用大孔樹脂法純化甘草酸粗品(甘草酸含量28.99%)，考察了2001-5、D141、D130、HPD-600、HPD-100型5種大孔吸附樹脂，以甘草酸收率、純度作為考察指標，進行綜合評價，并篩選出了最佳純化工藝：采用HPD-600型大孔樹脂，上樣溶液的甘草酸濃度10 mg·mL-1，pH值6.2，吸附流速2 BV·h-1，用60%乙醇洗脫，制備物中甘草酸純度可達95.02%。高宏等[24]通過正交試驗法篩選出AB-8型大孔樹脂對甘草酸的最佳動態吸附及解吸條件，即上柱液濃度為0.5 g·mL-1，柱徑高比為1∶8，最佳上樣流速為2 mL·min-1，采用30%的乙醇溶液除雜質，80%的乙醇溶液可以較好地洗脫下甘草酸。

此外，有研究人員將大孔樹脂法與其他方法結合以達到提取純化甘草酸的目的。宋麗軍等[25]在AB-8型大孔樹脂純化甘草酸工藝研究基礎上，用HPLC監控流分的成分變化，優化了分離純化方案，達到去除甘草提取物中甘草苷及其他雜質的目的，將甘草酸純度由26.3%提高到35.8%。孫嘯濤等[26]利用HPLC評價大孔樹脂純化甘草酸工藝，以甘草酸廢渣為原料制備甘草酸，結果顯示AB-8型大孔樹脂較D201型大孔樹脂更適于甘草酸的純化，最佳工藝條件：上樣液pH為6.0、甘草廢渣提取液的甘草酸濃度為5.89 mg·mL-1、以50%乙醇溶液進行洗脫，經樹脂純化后的產品的甘草酸純度為52.3%。

此外還有研究人員將大孔樹脂與聚酰胺樹脂進行聯合使用，如Zheng Y F先利用聚酰胺將甘草提取液中的黃酮類物質除去，再用HPD-400大孔樹脂進一步的純化，將甘草酸的純度由11.40%提升到88.95%，且回收率可達76.53%[27]。

1.3 甘草次酸

甘草次酸(glycyrrhetinic acid)屬于五環三萜類化合物，是甘草酸的苷元，甘草的根莖中有發現，甘草酸水解脫去糖鏈可生成甘草次酸，有18α和18β2種立體異構體[28]。藥理學研究發現甘草次酸具有一定的防癌和抗癌作用，同時具有抗病毒感染的作用，對致癌性的病毒如肝炎病毒、EB病毒及艾滋病病毒的感染具有抑制作用[29]，因此對其的研究越發引人矚目。

目前關于利用大孔樹脂分離純化甘草次酸的報道較少，曾啟華[30]采用水酸提取法從甘草中提取得到甘草酸粗品，用D101大孔樹脂進行甘草酸的純化，然后將甘草進行酸性加壓水解得到甘草次酸。

2 分離純化甘草黃酮類物質

2.1 甘草總黃酮

甘草總黃酮是甘草中一類重要的活性物質，目前已經從甘草中發現300多種黃酮類化合物，在藥理活性研究中發現甘草總黃酮具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素樣作用、降糖、降脂、抗癌、解痙、抗抑郁等作用。臨床上用于各類炎癥、急慢性肝損傷、腫瘤、心腦血管疾病、神經退化性疾病等的治療[12]。

李紅等[31]評測了AB-8、S-8、NKA、NKA-Ⅱ、D4020、D201、XDA-1、X-5型等大孔樹脂對甘草黃酮的吸附和解吸附的能力，發現XDA-1型大孔樹脂對甘草黃酮的動態吸附率為92.18%，動態解吸率為83.73%，對甘草黃酮類物質的選擇性較其他樹脂好。傅博強等[32]優化了XDA-1分離純化甘草黃酮的工藝，所收集的甘草黃酮部分不含有甘草酸，其優化條件為：上樣液pH為5，甘草酸濃度為1.5 mg·mL-1，總黃酮濃度為0.75 mg·mL-1，上樣流速為3 BV·h-1，用45%的乙醇1.5 BV·h-1洗脫，總黃酮收率為69.7%。廉宜君等[33]考察了D101、S-8、AB-8、DML30、HPD300、ADS-7、HPD100、HPD450型大孔吸附樹脂對甘草黃酮的吸附率和解吸率，結果發現HPD300樹脂對甘草黃酮有較好的吸附和解吸附效果。其吸附分離甘草黃酮適宜的條件：上樣液濃度為2.0 mg·mL-1，上樣流速1.5 BV·h-1，上樣量為2 BV；用3 BV 80%乙醇溶液，按1.5 BV·h-1洗脫，制備的黃酮純度是原來的2倍以上。李杰等[34]優化了AB-8型大孔樹脂對甘草黃酮動態吸附條件，并通過BP神經網絡進行建模，以模擬甘草黃酮動態吸附過程。結果表明黃酮吸附率可達93.12%；經遺傳算法優化的BP神經網絡訓練后可應用于甘草黃酮動態吸附過程的模擬。呂子明等[35]從12種大孔樹脂中篩選出AB-8對甘草總黃酮純化較好，并優化了純化工藝，在優選條件下，洗脫物中甘草總黃酮純度為38%。

2.2 甘草苷

甘草苷(Liquiritin)是黃酮類化合物中重要的單體活性成分，具有很強的藥理活性，現代研究發現甘草苷具有抗抑郁、神經保護、對肝臟毒性保護、對心臟系統的作用等，以及治療咽炎、急慢性咳嗽和痰多等癥[36]。

魚紅閃等[37]通過D101型和HP20型大孔樹脂純化甘草苷粗品，對甘草苷的最大吸附量分別為238.7 mg·g-1和278.9 mg·g-1，最佳乙醇濃度分別為50%和60%。

2.3 異甘草素

異甘草素(Isoliquiritigenin)是甘草中的一種異黃酮類化合物，有較強的藥理活性。現在研究發現異甘草素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、對心血管及氣管作用以及抗艾滋病等作用[38]。

付玉杰等[39]從HPD-600、D4020、D101、AB-8、NKA-II、AL-2和NKA-9中篩選出AB-8對異甘草素有較好的吸附與解吸附作用，利于異甘草素的分離純化。其最佳的吸附與解附條件為：在室溫下，以1.2 BV·h-1的流速上樣，上樣量為5 BV，且上樣液pH為5，再用70%的乙醇溶液，在1 BV·h-1的流速下洗脫4.5 BV，最后得到的異甘草素的純度由2.02%提高至29.1%，較處理前提高14.4倍。趙文灝等[40]通過對比AB-8、D101、Al-2、NKA-2型4種樹脂，同樣篩選出AB-8較適宜于異甘草素的富集純化，并發現AB-8在吸附異甘草素時是個吸熱過程，且在15～40 ℃吸附量隨溫度升高而增加，50%乙醇溶液洗脫得到產品，異甘草素含量為26%，回收率為33%。

2.4 光甘草定

光甘草定(Glabridin)為脂溶性黃酮類成分，存在于光果甘草的根及根莖，是光果甘草的特有成分，占甘草總黃酮含量的11%[41]。藥理研究發現其具有抑制黑色素形成作用、抗動脈粥樣硬化和降血脂作用、神經保護和增強記憶作用、雌激素樣活性、抑菌作用[42]，因其具有的抗氧化、抑制黑色素形成的作用顯著，在化妝品和醫療保健美容等領域，受到廣泛的關注[43]。此外還有報道稱，光甘草定或光甘草素具有抑制齲齒的作用[44]。

敖明章等[45]利用D101型大孔樹脂分離純化光甘草定，發現利用4 BV的90%的乙醇溶液，以3 BV·h-1的流速進行洗脫可以很好地將光甘草定洗脫下來，且洗脫物中光甘草定的含量達45%，回收率為67.79%。呂姣[46]聯合使用了HPD100和AB-8型大孔樹脂對光甘草定進行純化，首先用HPD100大孔吸附樹脂純化光甘草定，以30%乙醇溶液作為光甘草定的上樣溶液(0.5～0.6 mg·mL-1)，洗脫液體積8 BV，40%乙醇除雜，再以70%乙醇洗脫收集光甘草定，產品的純度為23.90%；為提高光甘草定的純度，再以AB-8大孔吸附樹脂進一步純化，產品純度提高至35.10%。

盡管光甘草定有著很好的活性，但目前對于其提取純化的研究并不多，利用大孔樹脂分離純化光甘草定有待進一步研究。

3 分離純化甘草多糖

甘草多糖( Glycyrrhiza polysaccharide，GPS)主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖組成。目前研究發現其有多種藥理活性，如抗炎[47]、抑菌[48]、免疫調節及抗腫瘤[49]等。

黃申等[50]從LSA-5B、D4020、D201、AB-8、S-8、XDA-I、NKA、NKA-II、X-5型9種大孔吸附樹脂中，篩選出LSA-5B適宜于甘草多糖的分離純化，其對甘草多糖的動態吸附率為56%，動態解吸率為99%。吳玉和[51]利用D301T和S-8除去多糖中的蛋白，色素含量顯著降低，并用自制的纖維素基大孔樹脂和聚乙烯醇基大孔樹脂對甘草多糖進行純化，且純化效果明顯好于傳統的脫蛋白方法sevag法、三氯乙酸法及活性炭法。

4 討論

甘草皂苷類、黃酮類成分及甘草多糖是甘草的主要活性成分，藥理活性的不斷深入研究增加了它們的市場需求。同時，隨著綠色環保理念的不斷深入，那些危害環境的傳統分離純化工藝已經不能滿足社會的需要，大孔樹脂法可以很好地替代傳統分離純化方法。此外，與聚酰胺法、膜分離法、泡沫分離法、高速逆流色譜法、雙水相體系法、模擬移動床色譜技術等多種新技術相比，大孔吸附樹脂法具有工藝簡單、成本低、無污染、效率高等優點。據統計，大孔樹脂法是目前常用的純化方法之一，已被廣泛應用于皂苷類、黃酮類、苷類和生物堿類等各種化學成分的分離、富集，是適用于工業化的工藝之一。

然而，大孔吸附樹脂法目前主要用于甘草酸的分離純化，而針對甘草中總黃酮和多糖兩類有效部位及其單體的分離純化研究較少，如甘草苷、光甘草定、甘草查耳酮A、甘草查耳酮等。這些單體及有效部位隨著藥理活性的不斷研究必將得到廣泛使用，因此，有必要加強大孔樹脂法在除甘草酸以外的甘草活性成分的分離純化研究。此外，雖然大孔樹脂法在甘草酸上應用廣泛，但是這都是只針對單一成分，往往在分離純化甘草酸的同時，造成了其他活性成分的浪費。如何在一個大孔樹脂分離純化工藝中將主要的活性成分，如甘草總皂苷、甘草總黃酮及甘草多糖等依此分離純化，在保護環境的同時做到物盡其用，筆者認為值得深入研究。另外，目前在甘草活性物質提取中應用的樹脂類型不統一，在生產應用時因重復性試驗而造成浪費；為取得最好的效果，應從樹脂的篩選、吸附量、解吸量及吸附動力學等方面進行深入研究，建立分離純化模型，進而找到最佳分離純化工藝。最后，對于大孔樹脂富集物的純度一般較低，可以考慮樹脂聯用，或者和聚酰胺等樹脂結合使用等。在這方面已有甘草酸的分離純化報道[27]，但是在甘草的其他活性成分研究方面應用較少，因此作者認為大孔樹脂與其分離純化方法聯合使用也有待深入研究。

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ProgressofApplicationofMacroporousResininSeparationandPurificationofGlycyrrhizauralensisActiveIngredient

CHENGXinyu1,HANYanan1,JINYanqing1,LIHongli1,HOUJunling1*,WANGWenquan2,3*

(1.InstituteoftraditionalChinesemedicine(TCM),BeijinguniversityofChinesemedicine,Beijing100102，China; 2.Instituteofmedicinalplants,Chineseacademyofmedicalsciences,Pekingunionmedicalcollege,Beijing100193,China;3.LabofEngineeringResearchCenterofGAPforChineseCrudeDrugs,MinistryofEducation,Beijing100102,China)

The roots ofGlycyrrhizauralensisare widely used in Chinese medicine,and the separation and purification of the active ingredient has been a research focus.This paper focus on：1.Betterly use macroporous resin in purifing active ingredients fromGlycyrrhizauralensisexcept glycyrrhizic acid.2.Different kinds of active ingredients through a macroporous resin column separation.3.Macroporous resin method combination with other methods to separate and purify.4.Establish a macroporous resin purification process model to guide industrial production.

Glycyrrhizauralensis;Active ingredients;Macroporous resin;Separation and purification

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.022

2013-10-11)