重復序列突變與神經退行性疾病

宿俊杰， 靳 玫， 劉曉利， 唐超智， 賈盼盼綜述， 王文晟審校

核苷酸重復序列普遍存在于真核生物基因組。在染色體上經常出現一些重復序列，如(CCG)n、(CCTG)n等。相比一般DNA序列，這些重復序列更不穩定。其拷貝數易增加或減少，導致重復序列擴展或縮減［1，2］。重復序列在DNA復制、轉錄、修復等過程中易形成二級結構，這些結構導致重復序列的變異，進而導致人類神經退行性疾病。神經退行性疾病(neurodegenerative disease，NDDs)是一種以大腦和脊髓細胞神經元喪失的為特征的疾病。隨著人口老齡化的發展，NDDs將超過癌癥，成為繼心血管疾病之后的第二大死亡原因。在神經退行性疾病中，有約40種是由重復序列的突變引起的。本文對重復序列不穩定的特征、機制及其與NNDs的相關性進行綜述。

1 與重復序列突變相關的神經性退行疾病

重復序列突變是一種獨特的變異，它和近40種神經退行性疾病相關。不像其他變異，重復序列的變異是動態的。引起各種NNDs的重復序列的類型、相關基因及位置等。

2 重復序列突變的機制

正確理解引發疾病的重復序列變異的機制對開辟新的治療途徑和研發新藥物至關重要。由于重復序列的特殊性，易形成非正常DNA二級結構。正常情況下，這些非正常的二級結構在DNA代謝過程中被清除掉，然而當清除過程異常時，就引起重復序列突變［1，2］。

2.1 重復序列的結構 重復序列易形成的非正常二級結構的特性與其對稱性，序列組成，超螺旋等方面的因素是密切相關的。雖然這些二級結構在細胞內無法探知，但在體外的實驗中許多已被證實。如(CCTG)n·(CAGG)n折疊形成發卡結構，(CCG)n·(CGG)n和(CGCG4CG4)n能折疊成G四鏈結構，(CTG)n·(CAG)n能形成“十字”結構，(GAA)n·(TTC)n在負超螺旋影響下能形成H-DNA。這些異常的DNA二級結構嚴重影響DNA復制、修復、同源重組及轉錄等過程［3］。下面就重復序列形成的二級結構導致重復序列的不穩定機制進行解釋。

2.2 重復序列突變形成的分子機制 對于重復序列是如何在DNA代謝過程中產生擴增或縮減的，有以下幾種機制。

2.2.1 DNA復制機制 在對酵母等的研究中發現許多參與DNA復制，特別是與岡崎片斷成熟過程中有關的蛋白質發生變異時引發急劇升高的重復序列的不穩定。DNA復制模型又包括兩種假說。第一種是Harvey于1997年提出的“鏈滑動”假說［4］。該假說認為，DNA復制過程中，含有不穩定重復序列的DNA單鏈作為模板合成新鏈時，會由于鏈的滑動作用造成堿基錯配，若錯配引起新生鏈上形成泡狀或者發夾等結構，該新生鏈作為模板鏈在下一輪復制時就會造成重復序列的擴增或縮減。近年，Mirkin提出在滯后鏈合成過程中復制叉的暫停與重新啟動假說，即在滯后鏈模板中，由重復序列形成的異常二級結構會拖延滯后鏈的合成，破壞其與前導鏈合成的協調性［3］。該模型可以在分子水平上解釋一些重復序列擴展的遺傳特征。

2.2.2 DNA修復機制 許多DNA修復包含了部分DNA復制的過程，像FEN1、PCNA等DNA復制的蛋白質同樣也參與了DNA修復，因而在修復過程中，重復序列的DNA同樣會形成滑動鏈的結構。另外，非有絲分裂的組織(如腦組織)或DNA修復缺陷的組織同樣出現大量的重復序列突變現象。因此DNA修復同樣也與穩定重復序列突變發生的過程有關。根據DNA修復的類型，造成重復序列的不穩定的原因可以從以下4個方面進行闡述。(1)錯配修復:在轉基因老鼠中，CAG/CTG的擴展離不開錯配修復蛋白質MSH2、MSH3和PMS2的功能。MSH2的變異導致重復序列的擴展停止。而MSH3的失活使CTG/CAG重復序列發生縮減，這為 CTG/CAG 疾病的治療提供了新思路［5～7］。(2)堿基切除修復(BER):研究發現HD和FXS小鼠氧化促進三核酸重復序列的擴展，雙氧水處理可誘導人的HD細胞的重復序列擴展，這些結果暗示重復序列的擴展是在堿基切除修復(BER)這一過程中產生的，另外，失去氧化堿基切除修復酶-8-鳥嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)功能的小鼠抑制重復序列擴展的發生的事實也支持了這一觀點［8，9］。在去除氧化堿基后，BER是通過部分DNA合成完成的。這一過程和岡崎片斷的成熟類似，產生的含重復序列的單鏈Flap會形成發卡和環狀中間物阻止FEN1切除重復的Flap，導致 DNA的擴展［10］。(3)核酸切除修復(NER):NER包括兩條途徑:轉錄耦合修復和全球基因組修復。ERCC1-XPF復合物切斷先于XPG，含有重復序列的單鏈DNA形成發卡或環狀的Flap，阻止了XPG的切除，導致重復序列突變［2］。在不同的研究中，CAG重復序列傾向于縮減。在人的細胞中，基因敲除NER的蛋白質ERCC1，XPG和CSB時CAG重復序列的縮減程度降低［11］。(4)雙鍵斷裂修復(DSBR):研究表明雙鍵斷裂和重復序列相關的復制異常有關。復制中產生的鏈滑動和復制叉暫停會產生雙鍵斷裂，最終通過基因交換和單鏈DNA結合來修復。具體將在DNA重組模型中加以闡述。

目前，DNA幾種修復途徑之間的交聯與寡核苷酸重復擴展之間的關系越來越引起人們的關注，并且，現在有證據傾向于認為混合途徑更為重要的［12］。比如MSH2-MSH6、BER糖基化酶和MUTYH形成結構復合體，以及上述的MSH2-MSH3和OGG1之間的關系來解釋BER和MMR與寡核苷酸重復序列長度變化的關系。

2.3 DNA重組機制 基因重組也參與了重復序列突變的發生過程。最簡單的一種機制是減數分裂過程中同源染色體上的重復運行之間的不平等交換導致擴展和縮減。重組修復模式認為DNA重組和DNA合成過程聯合，可以導致三核苷酸重復序列突變擴展。研究發現，重復序列擴展可促進自身不平等的姐妹染色單體交換，并且基因轉換期間經歷了頻繁的擴展［13］。另一種機制是在DNA修復過程中形成的單鏈DNA入侵雙鏈中的同源序列引起重復序列擴展。在滯后鏈模板中，通過一個可擴展的重復導致復制叉的拖延而形成一個穩定的二級結構，由真核細胞內切酶切割和加工這種結構，這個內切酶和細菌核酸酶SbcCD功能同源，會產生一個3’端重復序列擴展的單鏈DNA片段，能侵入姊妹染色單體，導致重復序列擴展［3］。

3 重復序列突變導致NDDs的機制

3.1 疾病相關基因功能的改變 重復序列擴展導致的突變發生在編碼區時，比如由多谷氨酰胺殘基polyQ片段介導的多聚谷氨酰胺病中，編碼蛋白的谷氨酰胺鏈延長，導致該蛋白在細胞內累積，對神經元產生了某種毒性。目前已經證明，polyQ長度的增加對細胞核具有毒性，是導致疾病發生的一個重要因素［14］。此外，異常擴展的polyQ突變蛋白可能與一種或幾種神經元中大量表達的易損傷的蛋白發生相互作用，導致選擇性神經元核內包涵體的形成和神經元變性。近年的研究發現，大量表達于SCA1患者Purkinje細胞和其它腦區的富含亮氨酸的酸性核蛋白就是一種在損傷的神經元中大量表達的蛋白［15］。再者，在HD和SCA1轉基因鼠模型以及HD患者的神經元中均發現含有擴增的polyQ的細胞核內包涵體［16］，由此推測這些核內包涵體可導致神經性失調或功能障礙。

3.2 異常RNA的產生 DM、FRAXA和FRAXE等疾病的三核苷酸重復擴展位于其致病基因的非翻譯區。在DM2中，其(CCTG)n擴增的重復片段被轉錄為RNA后，突變的RNA會滯留在核內，干擾肌核的正常功能，對肌纖維產生毒性［17］。其它可能有類似病理機制的疾病還有SCA8、SCA10、SCA12以及HDL2。

3.3 基因功能的丟失 通過阻斷或阻礙基因轉錄導致基因功能的丟失也會導致NNDs。比如，進行性肌陣攣癲癇(EPM1)是由于半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(cystatin B)基因轉錄起始點上游啟動子中的重復序列(C4GC4GCG)n發生擴展，阻斷轉錄因子，導致轉錄功能喪失而引起的。

3.4 表觀遺傳學修飾 研究發現，SCA2致病基因ATXN2啟動子區域CpG的DNA甲基化水平與患者(CAG)n的擴展有關［18］。另外，FRDA患者致病基因fxn位點的核小體核心組蛋白H3的第9位賴氨酸殘基大多處于甲基化修飾狀態，說明FRDA患者細胞內FXN蛋白的編碼基因所在的染色質部位是處于抑制狀態，這樣的染色質狀態可能影響轉錄的延伸［19］。在細胞核內，組蛋白乙酰化與去乙酰化過程處于動態平衡，Debacker等發現特殊的HDAC在出芽酵母和人類星形膠質細胞中均能促進(CTG)n的擴增［20］。

4 總結與展望

過去的研究對重復序列突變的機制的理解已有很大提高。給由此引起的神經性退行疾病的治療帶來了希望。如抑制MSH3的活性可使重復序列縮減同時不造成整個染色體的不穩定和發癌的現象。本研究小組發現利用解旋酶，可消除DNA復制或修復中重復序列產生的發卡或泡狀結構等二級結構，阻止重復序列的擴展。通過特定目標假尿苷化實現翻譯終止。使擴展的重復序列在翻譯時提前中止，產生正常的產物。研究同時也顯示出重復序列突變的復雜性。部分原因在于重復序列的突變不是單一機制完成的，而是多種DNA代謝過程疊加的結果。另外變異的發生對于不同的階段，組織和細胞而言是獨特的。只有把隱藏的由重復序列突變引起的神經退化性疾病的致病機制逐步理清，才能針對神經退化性疾病加以有效的預防、早期診斷和治療。因此從基礎研究到開發出對重復序列變異引發的神經性退行疾病有效的發治療方法還有相當的路要走。

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