宏基因組學與動物病原微生物檢測

吳舊生，王鵬歧，劉月環

(1.浙江大學動物科學學院，杭州 310058；2.浙江省醫學科學院，杭州 310013)

宏基因組學(metagenomic)，又稱環境基因組學(environmental genomics)，檢測技術上不依賴培養，直接從微生物的天然環境中提取基因組DNA，對微生物群體進行研究分析，最大限度地挖掘微生物資源。宏基因組學技術是尋找新基因、開發新的生物活性物質、研究群落中微生物多樣性的新途徑， 目前已成為國際微生物學研究的熱點，本文對宏基因組學及其研究技術在人、動物微生物研究及檢測中的應用進行綜述，展望未來的發展趨勢和研究重點。

1 宏基因組學提出

迄今為止，人類對微生物世界的認識基本上都集中在不到1%的微生物上，環境中絕大多數的微生物還未被研究過甚至是被知道，主要是因為99%以上的微生物目前都是 難 被純培養的[1]，這己經成為現今微生物學界的普遍共識。Schmidt等[2]于1991年直接提取海水樣品DNA進而構建了λ噬菌體文庫，并進行了16S rRNA基因的篩選分析。1996年，Stein等[3]克隆了40 kb的一種未知海洋古細菌的基因組片段，并進行了測序分析，該項研究有里程碑式的意義。Handelman等[4]1998年提出一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法， 并首次使用了metagenomics(metagenome)這個名詞，中文譯為“宏基因組學”。文獻中的環境DNA文庫(Environmental DNA libraries)，土壤DNA文庫(soil DNA libraries)，eDNA文庫(eDNA libraries)，重組環境文庫(recombinant environmental libraries)，全基因組文庫(whole genome treasures)，群體基因組(community genome)，全基因組鳥槍法測序(whole genome shotgun sequencing)等都是相近的定義或名稱。宏基因組學(metagenomics)是將環境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體來研究微生物與自然環境、或生物體之間的關系[5]。

2 宏基因組學的研究現狀、方法與困難

最初宏基因組學的基本研究策略是樣品和基因(組)的富集→提取特定環境中的基因組DNA→構建宏基因組DNA文庫→篩選目的基因→目的基因活性產物表達。宏基因組學不僅克服了微生物難以培養的困難，結合生物信息學的方法，還可揭示微生物之間、微生物與環境之間相互作用的規律，大大拓展了微生物學的研究思路與方法，為從群落結構水平上全面認識微生物的生態特征和功能開辟了新的途徑。目前，微生物宏基因組學已經成為微生物研究的熱點和前沿，廣泛應用于環境保護(氣候、水處理、極端環境、海洋資源)、人體(動物)腸道(含呼吸道、皮膚、生殖道)、石油污染修復、生物冶金等領域，取得了一系列引人矚目的重要成果。

宏基因組學的研究方法主要包括序列分析法、同位素探測技術和二代測序技術。

序列分析法 (sequence driven screening method)，又包括基于探針的探針雜交技術、基因芯片技術和焦磷酸技術等。探針雜交技術現用于土壤基因文庫的篩選[6]，被有效地用于鑒定系統發育學中的標志基因和帶有高度保守域的酶基因[7]。Sebat等[8]利用芯片技術對其所研究的微生物群落基因組進行篩選， 鑒定出多個新的微生物種群。Wagner等[9]應用DNA微陣列技術對活性污泥中微生物的群落結構進行了研究，獲得了大量新的信息，該方法的缺陷是低豐度微生物難以分析。而焦磷酸測序(pyro sequencing) 的出現則大大的提高了測序的效率[10]。

在復雜群落構建的宏基因組文庫中找到特定的目的基因，需要篩選和測序成千上萬的克隆，通過同位素探測技術 (stable isotope probing，SIP )研究特定代謝過程的生物基因組，克隆從SIP實驗中獲得的13C標記的核酸，從而構建一個因吸收了特定的基質而在環境中執行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫，這極大地減少了需要篩選的克隆數量[11]，是目前在分子微生物(生態學)領域應用比較廣泛的方法之一。二代高通量測序廣泛應用是宏基因組學得以長足發展的基礎，并使得宏基因組技術應用于人類及各類家畜等動物的胃腸道微生物群落結構和功能研究[12]。

雖然宏基因組學研究正極大限度地發掘及發揮了人們難以想象到的微生物群落的巨大功能，然而它也面臨著一些困難。首先，不同的取樣和DNA提取方法決定了宏基因組研究的結果，如何對這些方法進行標準化是宏基因組學研究的一個難點。第二，由于許多基因或基因產物在外源宿主中不表達或表達后沒有活性，限制了后期的研究，因而建立更多的適于不同基因表達的宿主系統是基于功能篩選的宏基因組學研究的又一困難。第三，數據分析及生物信息學分析方法、微生物培養技術及模式微生物全基因組序列獲得等方面的規范有待于提高。因此，建立較規范宏基因組數據庫，供不同領域及各個國家的研究人員共享使用，將更有利于對宏基因組學研究結果的解釋和利用。

3 宏基因組學與人類疾病

人類消化道(包括胃腸道、口腔)，呼吸道、 泌尿生殖系統、皮膚等是各類微生物存在的天然場所，因此由其構成的人類疾病的宏基因組學研究也相繼開展。如美國國立環境衛生科學研究所( national institute of environmental health sciences，NIEHS ) 于1998年啟動了環境基因組計劃(environmental genome project，EGP)，意在就環境與基因相互作用及其對人類健康的影響進行系統全面的研究，主要內容包括環境脅迫對機體遺傳變異的過程和機理，發掘環境應激和應答基因的多態性及探討這些多態性基因的功能及其與患病風險的關系。2007年美國國立衛生研究院(NIH)啟動的人類共生菌群基因組計劃(human microbiome project，HMP)正是這方面的深入展開的重要支持與表現。由我國科學家(華大基因公司)參加的歐洲人體腸道宏基因組研究計劃 (european metagenomics of the human intestinal tract，MetaHIT)，對124例歐洲人腸道菌群基因組樣本用新一代大規模高通量測序技術進行深度測序，獲得330萬個人體腸道宏基因組的參考基因，約是人自身基因的150倍，這些基因信息可以估計人腸道中存在約1000～1150種細菌，這些細菌是絕大部分個體所共有的且是未知的[13]。

宏基因組技術提供了較為全面的菌種多樣性分布的特征，在研究探討人類疾病中不可培養的微生物多樣性已有了較大進展，如Breitbart等[14]用鳥槍測序法對人體排泄物的宏基因組文庫進行研究， 結果表明獲得的病毒大約有1200種基因型，大多數為新病毒， 可能與人類疾病有著密切的關系。Gill等[15]對2名健康成年人糞便標本的DNA進行測序后發現，僅有1%～5%的DNA不是來自細菌，消化道細菌的基因數量達60000 多種， 比在人類基因組中發現的多出一倍，是由細菌和人體細胞組成的混合體，該研究結果對許多人類疾病的臨床診斷和治療研究具有深遠的意義。Kurokawa等[16]對13個處于不同年齡層的健康人體糞便微生物種群進行了研究， 表明未斷奶嬰兒的具有較大個體差異性， 而成人及已斷奶兒童則呈現出高度的功能一致性。2008年Finkbeiner等[17]通過構建12個腹瀉小孩腸道內容物宏基因組文庫， 發現得到的病毒序列與GenBank中的已知序列同源性很低。同時，利用二代測序技術對口腔、呼吸道、皮膚等部位的菌群及與相關疾病的宏基因組學研究也取得了較大進展。Keijser等[18]利用高通量測序系統對多個健康人唾液及牙菌斑合并樣品的研究發現，總數為19萬個細菌的16S rRNA序列中，在唾液和牙菌斑中分別鑒定出185和267個細菌屬，分別涵蓋了5600和10000個不同菌種。Zaura等[19]對健康人口腔菌群的研究表明：利于健康的核心細菌數超過500種以上，使人們對口腔菌群細菌的數量有了新的認識。Willner等[20]檢測了5名囊性肺纖維化病人和5名健康呼吸道的病毒宏基因組序列后發現，病人組檢測到175個獨特的病毒基因型，且以編碼芳香族氨基酸為主，提示呼吸性病毒與囊性肺纖維化有潛在的關系。Gao等[21]用16SrDNA測序的方法發現正常人群的手、身體表皮微生物群落呈現高度多樣性。

以上成果顯示，宏基因組學技術在探索人體與不可培養病原菌相互關系的研究方面將有著廣闊的應用前景。

4 宏基因組學與動物免疫及致病

動物的胃腸道中存在著大量的共生微生物群落，構成了動物消化道微生物區系，正常腸道微生物對宿主具有營養、免疫、生長刺激與生物拮抗等作用，它們通過寄主胃腸道中特定環境，利用種群間的互作，在動物胃腸道中形成一種穩定的微生態環境。長期以來，對于胃腸道微生物的研究是建立在純培養技術上[22]。宏基因組技術可以不依賴實驗室培養條件，有可能使人們更加全面地認識腸道微生物的致病機制，尋找預防和治療的方法。

如利用宏基因組技術對倭蜂猴糞便微生物的結構組成及其潛在功能研究表明，在人類所占比例較小的Proteobacteria和Actinobacteria在倭蜂猴中更為普遍，而在人類中的優勢菌群Firmicutes在倭蜂猴中卻是少數。同時，通過對倭蜂猴與人及其他一些動物的胃腸道宏基因組數據進行雙向聚類發現，雖然倭蜂猴和小鼠腸道系統的功能有差異，但其微生物群落結構卻最為相似[23]。Zhu等[24]通過分析大熊貓腸道微生物宏基因組，發現了包括纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等在內的多種糖苷水解酶編碼基因，這些研究更進一步證實了胃腸道微生物與其宿主之間的共同進化，其代謝產物能影響宿主粘膜系統的發育、血管的發生、腸道上皮的更新、腸道功能的維持及參與宿主基因的表達[25]。

自Muyer等[26]1993年首次用變性梯度電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(主要分析16S rRNA區段)分析土壤環境的微生物區系以來，該技術已廣泛用于人類、動物腸道微生態及其它環境微生態的研究[27-28]。典型的如高倩等[29]用DGGE法結合免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)方法研究了三種不同級別實驗小鼠(普通級小鼠，清潔級小鼠和SPF小鼠)腸道菌群組成與腸黏膜相關淋巴組織sIgA陽性細胞分布，結果表明普通小鼠腸道細菌種類、數量及sIgA陽性細胞分布數量及部位均為最多，與清潔級、SPF級小鼠有明顯差異。利用非培養法研究鱗翅目昆蟲模式動物—家蠶腸道內容物發現家蠶腸道中寄生有16種以上的細菌[30]。Rawls等[31]發現，斑馬魚(Danio rerio)腸道中某些微生物可以刺激腸道上皮細胞增殖，促進營養物質代謝，刺激斑馬魚自身免疫系統的應答反應。

另外，胃腸道微生物被認為是藥物、酶基因和其他新型產品的來源，目前國內外研究者已通過構建動物胃腸道微生物宏基因組文庫或對宏基因組進行直接測序，成功篩選到多種糖苷水解酶及淀粉酶、脂酶/酯酶等酶類基因[32]。總之，借助于大規模測序和生物信息學分析，在動物胃腸道微生物群落的宏基因組學方法中，發現大量過去無法得到的未知微生物的新基因或基因簇，大大拓展了研究范圍，積累了大量基因序列信息，這一新的研究思路的引進，使得未來動物胃腸微生物間互作機理更加深入，使得研究動物胃腸道代謝定向調控成為可能，為動物性疾病防治、開發和利用動物胃腸道微生物資源提供了有力的技術支持。

5 宏基因組學在動物病原微生物研究上的應用及策略

因為宏基因組學技術可以避開傳統的培養方法，在DNA水平來探討機體，機體微生物群落結構及其與環境微生物的關系，利用此法可快速可靠地獲得體內、體表(胃腸道、呼吸道、口腔、生殖道、皮膚)微生物中各種微生物的菌落指紋和特征性核苷酸序列，為疾病診斷和微生物資源發掘提供信息與依據，而且宏基因組方法多數是基于核酸分子雜交技術、PCR技術、基因芯片技術等檢測方法，自動化程度高，可以準確靈敏地鑒定病原微生物，未來宏基因組學在病原微生物研究與診斷疾病方面的發展和應用可能主要集中在以下幾個方面：

5.1 利用營養和生境差異選擇性富集目的基因組

在宏基因組文庫篩選過程中目的基因僅占總DNA的一小部分，如何獲得這些腸道固有微生物的基因組并有效地減少宿主的基因組和外源DNA干擾是研究動物腸道微生物宏基因組的關鍵。為提高檢出率，需要對樣品進行預富集。目前預富集技術主要分為細胞水平富集和基因組水平富集。使用較多的是營養選擇及物理化學指標選擇來富集目的基因組(盡管這樣做丟失了菌種的多樣性)，基本做法是通過利用選擇培養基對目的微生物進行富集培養， 如用 42 羥基丁酸作唯一的碳源和能源篩選到能夠穩定利用42羥基丁酸的克隆子， 經分析這些克隆子具有42羥基丁酸脫氫酶活性， 據此可以利用該基因編碼的活性物質開展實驗室純培養[33]。對于一些不可純培養的病原微生物，實驗動物上典型的如泰澤菌(Tizzer)，可以以其致病靶器官(組織)為樣品，構建和篩選宏基因組文庫進行富集，再利用克隆測序或直接二代測序的方法來檢測鑒定，增加了病原微生物檢出的機會。

5.2 宏基因組數據庫的建立

對于病原微生物的檢測和研究，一部分工作需要做流行病學調查，因此描述疫源地病原微生物群落的基本特征，明確各生境下微生物群落的宏基因組學特征是關鍵的第一步，也相當于為大規模利用高通量檢測技術進行預篩選和為應急快檢提供標準品，其中的基因組特征(如16SrRNA序列的比對分析，是細菌種屬的鑒定與群體調查分析的有效手段)、生物信息數據及描述規范就成為未來動物病原檢測的重要內容和結果判定的依據。

5.3 高通量篩選

高通量測序技術和基因芯片技術作為宏基因組學最為成熟的重要技術，其全面性、準確性以及信息的深入程度都令其他傳統技術無法企及。在幾種高通量(二代)測序技術中，羅氏454測序技術和Illumina測序技術是目前應用宏基因組學研究中應用的主流。隨著高通量測序技術的發展，功能基因芯片將微生物群落的結構和功能緊密結合，與高通量測序技術相互補充， 可用于對病原微生物群落功能結構和代謝功能的研究。

5.4 大力發展動物病原微生物宏基因組學的生物信息學

高通量測序和基因芯片等技術為病原微生物研究提供了極大的數據量，如何從這些海量數據中挖掘有效信息，成為宏基因組學研究的一大難題。特別是隨著高通量檢測技術成本不斷下降、通量逐漸提高、準確度越來越有保障，生物信息學(bioinformatics)的發展將成為制約微生物研究的瓶頸[34]。最近，Deng等[35](2012)基于高通量數據成功構建了分子生態網絡(molecular ecological networks， MENs)，該網絡可根據數據固有特性自動選擇閾值，可較好地反映環境中微生物之間的相關性，并且對高通量技術普遍存在的高噪音問題有很好的耐受性，因此大力發展動物病原微生物信息學及其網絡平臺是今后的重要任務之一。

參考文獻：

[1] Kellenberger E. Exploring the unkown-The silent revolution of microbiology[J]. EMBO Reports，2001，2(1)，5-7.

[2] Schmidt T，DeLong EF，Pace NR. Analysis of a marine picoplankton community by16srRNA gene cloning and Sequencing[J]. J Bacteriol，1991，173(14):4371-4378.

[3] Stein JL，Marsh TL，Wu KY，etal. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment front planktonic marine archaeon[J]. J Bacteriol，1996，178(3):591-599.

[4] Handelsman J， Rondon MR， Brady SF，etal. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products[J]. Chem Biol， 1998，5(10)， R245-R249.

[5] Zengler K， Palsson BO. A road map for the development of community systems (CoSy) biology[J]. Nat Rev Microbiol，2012，10，366-372.

[6] Knietsch A，Waschkowitz T，Bowien S，etal. Construction and screening of metagenomic libraries derived from enrichment cultures: generation of a gene bank for genes conferring alcohol oxidoreductase activity on Escherichia coli[J]. Appl Environ Microbiol.，2003，69(3) : 1408-1416.

[7] Daniel R. The metagenomics of soil [ J ]. Nat Rev Microbiol， 2005，3 (6): 470- 478.

[8] Sebat JL，Colwell FS，Crawford RL. Metagenomic profiling:microarray analysis of an environmental genomic library[J]. Appl Environ Microbiol，2003，69 (8):4927-4934.

[9] Wagner M，Nielsen PH，Loy A，etal. Linking microbial community structure with function:fluorescence in situ hybridization micro-autoradiography and isotope arrays[J]. Curr Opin Biotechnol，2006，17(1):83-91.

[10] Margulies M，Egholm M，Altman WE，etal. Genome sequencing in microfabricated high density picolitre reactors [J]. Nature，2005，437(7057):376-380.

[11] Lu Y，Conrad R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere[J]. Science， 2005，309 (5737) :1088-1090.

[12] Swanson KS，Dowd SE，Suchodolski JS，etal. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice[J]. ISME J，2011， 5(4): 639-649.

[13] Qin J，Li R，Raes J，etal. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature， 2010， 464(7285): 59-65.

[14] Breitbart M，Hewson I，Felts B，etal. Metagenomic analyses of an uncultured viral community from human feces[J].J Bacteriol， 2003， 185(20): 6220-6223.

[15] Gill SR，Pop M，Deboy RT，etal. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome[J]. Science， 2006，312(5778)， 1355-1359.

[16] Kurokawa K，Itoh T，Kuwahara T，etal.Comparative metagenomics revealed commonly enriched gene sets in human gut microbiomes[J].DNA Res，2007，14(4):169-181．

[17] Finkbeiner SR，Allred AF，Tarr PI. Metagenomic analysis of human diarrhea: Viral detection and discovery[J]. PLoS Pathog，2008，4(2): e1000011. doi: 10.1371/journal.ppat.1000011.

[18] Keijser BJ，Zaura E，Huse SM，etal. Pyrosequencing analysis of the oral microflora of healthy adults[J]. J Dent Res，2008，87(11): 1016-1020.

[19] Zaura E，Keijser BJ，Huse SM，etal. Defining the healthy"core microbiome＂of oral microbial communities[J]. BMC Microbiol，2009，9:259.doi: 10.1186/1471-2180-9-259.

[20] Willner D，Furlan M，Haynes M，etal. Metagenomic Analysis of Respiratory Tract DNA Viral Communities in Cystic Fibrosis and Non-Cystic Fibrosis Individuals[J]. PLoS ONE，2009，4(10): e7370. doi:10.1371/journal.pone.0007370.

[21] Gao Z，Tseng CH，Pei ZH，etal.Molecular analysis of human forearm superficial skin bacterial biota[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(8):2927-2932.

[22] 馮育芳，邢進，王吉，等. 普通環境長爪沙鼠腸道菌群的分離鑒定[J].實驗動物科學，2012，29(3)：27-30.

[23] Xu B，Xu W，Yang F，etal. Metagenomic analysis of the pygmy loris fecal microbiome reveals unique functional capacity related to metabolism of aromatic compounds[J]. PLoS ONE， 2013;8(2):e56565. doi: 10.1371/journal.pone.0056565.

[24] Zhu L，Wu Q，Dai J，etal. Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108 (43): 17714-17719.

[25] Smith AH，Mackie RI. Effect of Condensed Tannins on Bacterial Diversity and Metabolic Activity in the Rat Gastrointestinal Tract[J]. Appl Environ Microbiol， 2004，70(2):1104-1115.

[26] Muyzer G，De Waal EC，Uitterlinen AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16SrRNA[J]. Appl Eviron Microbiol， 1993，59(3): 695-700.

[27] Satokari RM，Vauqhan EE，Akkermans AD，etal.Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis[J].Appl Eviron Microbiol，2001，67(2):504-513.

[28] Zhu WY，Williams BA，Konstantinov SRetal. Analysis of 16S rDNA reveals bacterial shift during in vitro fermentation of fermentable carbohydrate using piglet faeces as inoculum[J]. Anaerobe.2003，9(4):175-180.

[29] 高倩，王友明，吳舊生. 腸道菌群變化對實驗小鼠腸黏膜免疫的影響[J].中國實驗動物學報，2012，20(5):45-49.

[30] 袁志輝，藍希鉗，楊廷，等. 家蠶腸道細菌群體調查與分析[J].微生物學報.2006，46(2):285-291.

[31] Rawls JF，Samuel BS，Gordon JI．Gnotobiotic zebra fish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(13):4596- 4601.

[32] López-López O，Cerdán ME， Gonzalez-Siso MI. New Extremophilic Lipases and Esterases from Metagenomics[J]. Curr Protein Pept Sci， 2014 Feb 28[Epub ahead of print]，(PMID:24588890).

[33] Gabor EM，de Vries EJ，Janssen DB. Construction，characterization， and use of small insert gene banks of DNA isolated from soil and enrichment cultures for the recovery of novel amidases[J]. Environ Microbiol，2004，6(9):948- 958.

[34] Simon C，Daniel R. Metagenomic analyses:past and future trends[J]. Appl Environ Microbiol， 2011，77(4)， 1153-1161.

[35] Deng Y，Jiang YH，Yang Y，etal. Molecular ecological network analyses[J]. BMC Bioinformatics，2012 May 30;13:113. doi: 10.1186/1471-2105-13-113.