2月齡和4月齡大鼠制備心肺復蘇模型后神經功能評價及亞組評分的比較

田 欣，王 晶，趙芯晨，周小超，閆 峰，何婧瑜，郭德玉

(首都醫科大學宣武醫院，北京 100053)

心跳呼吸驟停是臨床常見的急危重癥。據美國心臟病協會及卒中委員會統計結果，美國2008 年有院外心跳驟停166,200名患者，40,000名患者心肺復蘇(cardiopulmonary resuscition，CPR)成功后進入ICU 接受進一步治療，超過50%的患者遺留嚴重神經功能障礙[1]。我國僅據2008 年阜外醫院國家“十一五”課題結果顯示：中國每年約54.4萬人因心源性“猝死"需進行CPR[2]。心臟驟停 (cardiac Arrest，CA)和心肺復蘇是復雜的病理生理變化過程。許多發病機制尚不清楚．由于臨床研究受多方面因素的干擾，深入研究CPR的病理生理機制受到一定限制。動物模型是較為理想的載體模型，能夠對各種混雜因素進行嚴格控制，并且實驗結果具有可重復性。因此建立一個良好的動物模型，可為人類疾病發病機制的研究提供實驗平臺。作為如何減輕CPR 后患者神經功能障礙，促進神經功能的恢復的基礎研究：制備一種穩定可靠的動物模型，在當前是應該首要解決的。

1 材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器

0.1%鹽酸腎上腺素注射液 (天津金縷氨基酸有限公司，批號：0508201),0.9%生理鹽水注射液(天津百特醫療用品有限公司),肝素鈉注射液(江蘇常州升華千紅制藥有限公司),恩弗烷(河北九派制藥有限公司 Enflurane)。

電生理刺激器(日本光電，SEN-3301)，食道電極(江蘇電子儀器廠)，小動物麻醉罐(美國NatureGene Corp，tech3)，小動物呼吸機(美國Harvard，MA1 55-7058)，多導生理記錄儀(美國BIOPAC，MP150)，電子天平(美國OHAUS)，顯微鏡(Olympus，DP70)。

1.2 實驗動物與分組

SPF 級SD雄性大鼠，2月齡16只，4月齡16只,北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，飼養在宣武醫院動物房【SYXK(京)2010-0013】。動物隨機分組：(1)4月齡假手術組(OC組，n=8)；2月齡假手術組(YC，n=8)(2)4月齡心肺復蘇模型組(OM組，n=8)；2月齡心肺復蘇模型組(YM組，n=8))。

1.3 經食管心臟起搏誘發室顫

大鼠術前不禁食，顯微鏡下經口氣管插管，插入16 g套管接小動物呼吸機，持續以1%～2%恩弗烷聯合30%氧氣、70%N2O混合吸入全麻。分離左側股動靜脈：經股動脈插入PE50管接MP150生理記錄儀血壓測量系統，監測動物血壓改變；經股靜脈插管，開放靜脈給藥通道；經四肢皮下針記錄標準Ⅱ導聯心電圖,動態監測動物心電圖改變；經肛門監測肛溫，維持體溫37℃±0.5℃。

4極5F起搏電極經口插入食管約7 cm ,電極近端與刺激輸出端相連。測定心室起搏閾值,誘發室顫電壓應高于起搏閾值6～8V(28～36V)，頻率20～30 Hz，脈寬10 ms。超速起搏，直至大鼠室顫、心跳停搏、逸搏等持續存在，血壓小于25 mmHg，正常的脈搏波形消失，提示誘導室顫成功，停止起搏。6 min后進行CPR：經股靜脈注射腎上腺素40 μg/ kg；打開小動物呼吸機，根據大鼠體重由呼吸機自動設定通氣頻率,潮氣量為6 mL/kg；人工手法行胸外心臟按壓,頻率200次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑1/ 3。持續 3 min，未復蘇大鼠進行5J非同步電除顫；總復蘇時間超過15 min剔除。大鼠恢復室上性心率，收縮壓超過60 mmHg并持續10 min以上，認為復蘇成功。實驗全程監測心電和血壓，超出規定范圍者剔除。

1.4 室顫過程中生理指標的監測

不同月齡的SD大鼠電刺激過程中血壓的監測比較。不同月齡SD大鼠致CA過程中持續電刺激時間、CPR時間與血壓變化的統計。

1.5 各組大鼠不同時間段神經功能缺失評分(neurologic deficit scores，NDS)

按照心肺復蘇后國際通用的80分NDS評分[3-4]細則，復蘇前3 d評價大鼠神經功能，剔出NDS最好或最差的大鼠；ROSC后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，由受專業訓練的兩個實驗員對各組SD大鼠采用雙盲法進行獨立評分，最終NDS評分取兩者平均值。

1.6 各組大鼠不同時間段復蘇組神經功能亞組評分：

選取平衡木實驗，網格實驗，懸崖回避實驗進一步評估動物運動協調能力，選取疼痛刺激實驗進一步評價感覺功能。復蘇前3 d評價大鼠神經功能，剔出NDS最好或最差的大鼠；ROSC 后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，由受專業訓練的兩個實驗員對各組SD大鼠采用雙盲法進行獨立評分，最終NDS評分取兩者平均值。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 不同月齡的SD大鼠電刺激過程中血壓的監測比較

經食道電刺激致CA過程中，2月齡大鼠血壓維持在80～90 mmHg不變，直到CA出現血壓驟降至25 mmHg(圖1)；而4月齡大鼠血壓從電刺激初期到CA出現一直維持在40～50 mmHg，CA出現時血壓驟降至20 mmHg以下，甚至直線。(圖2)。

2.2 不同月齡SD大鼠的成模率及死亡率統計：

4月齡組8只大鼠，成模7只，成模率87.5%，死亡1只，死亡率12.5%，；2月齡組大鼠成模5只，成模率62.5%，死亡1只，死亡率12.5%。

2.3 不同月齡SD大鼠誘發CA過程中持續電刺激時間、CPR時間與血壓變化的統計(表1)

在電刺激誘發CA過程中，4月齡組大鼠與2月齡組大鼠電刺激前血壓無顯著差異的情況下，誘發CA的總時間，以及發生CA進行復蘇搶救的時間無顯著差異；而在此過程中造成的血壓變化，有極顯著性差異(P< 0.01)。

2.4 各組大鼠復蘇后 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d神經功能評分NDS(neurologic deficit scores)的情況：(表2)

在NDS總評分中，兩個月齡的模型組與對照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h評分均有顯著性差異(P< 0.05)，7 d無顯著性差異。

在NDS總評分中，OC組(4月齡假手術組)與YC組(2月齡假手術組)之間相比較，6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；OM組(4月齡心肺復蘇模型組)與YM組(2月齡心肺復蘇模型組)之間相比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異。

2.5 各組大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d NDS亞組評分結果分析：

2.5.1 各組大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d網格實驗評分結果(表3)：

在網格實驗中，兩個月齡的模型組與對照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均有顯著性差異(P< 0.05)；不同月齡的對照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h評分有顯著性差異(P< 0.05)，72 h、7 d評分無顯著性差異。

表1 2月齡心肺復蘇模型組(YM組)與4月齡心肺復蘇模型組(OM組)大鼠電刺激與血壓變化

圖1 YM組大鼠電刺激過程中血壓變化不明顯

圖2 OM組大鼠電刺激過程中血壓維持低灌注狀態

表2不同月齡組大鼠各時間點NDS評分結果

Tab.2The NDS score of rats at different ages group

注：神經功能評分，OM組與OC組相比：*P < 0.05，**P < 0.01；YM組與YC組相比：◆P < 0.05，◆◆P < 0.01。

表3 不同月齡組大鼠各時間點網格實驗評分結果

2.5.2 各組大鼠大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d平衡木實驗評分結果(表4)：在平衡木實驗中，不同月齡的模型組與對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均有顯著性差異(P< 0.05)；不同月齡的對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h、24 h評分有顯著性差異(P< 0.05)，48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異。

表4 不同月齡組大鼠各時間點平衡木實驗評分結果

2.5.3 各組大鼠大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48h、72 h、7 d懸崖回避實驗評分結果(見表-5)：在懸崖回避實驗中，2月齡組大鼠模型組與對照組6 h評分有顯著性差異(P< 0.05)，而12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異；4月齡組大鼠模型組與對照組6 h、12 h、24 h、48h、72 h、7 d評分無顯著性差異。不同月齡的對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異。

表5 不同月齡組大鼠各時間點懸崖回避實驗評分結果

表6 不同月齡組大鼠各時間點疼痛刺激實驗評分結果

2.5.4 各組大鼠大鼠復蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d疼痛刺激實驗評分結果(表6)：在疼痛刺激實驗中，2月齡組大鼠模型組與對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d均有顯著性差異(P< 0.05)，4月齡組大鼠模型組與對照組12 h、24 h、48 h、72 h有顯著性差異(P< 0.05),7 d評分無顯著性差異。

不同月齡的對照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評分均無顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h有顯著性差異(P< 0.05)，而24 h、48 h、72 h、7 d評分無顯著性差異。

3 討論

目前，心肺復蘇領域的實驗研究大多基于兩種方法的動物模型：窒息法與電刺激誘發竄顫法致心搏驟停。國內的研究較多采用窒息法模型[5-6]，而國外的研究多采用室顫法動物模型[7]。心肺復蘇動物模型的制作方法有難有易，應根據實驗目的、實驗室具備的條件(設備、技術力量)、實驗經費等綜合分析，選擇最適宜的動物模型。自Utstein-Style指南頒布以來，心臟驟停動物模型實驗研究及文獻報道已逐步規范與統一通過Utstein-Style指南對各心臟驟停動物模型實驗研究的總體引導，統一化、標準化各種動物模型的制作方法和評估參數，反復驗證各種方法的可行性和可重復性，實驗研究者們可以選擇到一種與各自研究的疾病有最為相似的病理生理學改變和血流動力學變化，與臨床病例有良好相關性的最佳動物模型。

CPR后，腦損傷的病理生理過程其實質是腦缺血缺氧再灌注損傷的過程，病理機制涉及到：微循環障礙、自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、鈣超載及神經元信號轉導通路異常等各種因素相互促進，導致神經元死亡，引起神經功能障礙[8]。

當前研究發現，實驗動物模型多利用血管夾閉或窒息等方法制備全腦缺血再灌注模型研究神經損傷的機制，與心源性心跳驟停相比它們在病理生理過程上存在較大差異，實驗結論不能完全共用[9-10]；在研究內容方面，大多數研究僅限于對神經元存活、代謝、功能等某一方面的作用，對CPR 后神經保護方面的綜合評價，研究極少。

理想的動物模型將盡可能反映出臨床病理生理變化過程，這對于心肺復蘇研究質量有重要意義。本研究應用交流電生理刺激儀經食道調搏誘發大鼠心搏驟停模型，意在尋找更簡單、更接近臨床實際的研究模型。

本實驗選用經食道起搏誘發室顫制備大鼠心肺復蘇模型，擬對比分析2月齡與4月齡大鼠型在復蘇過程中各項監測指標的變化，并分析監測指標；以及CPR 后各時間點NDS 及亞組評分的情況，試圖綜合評價不同月齡大鼠制備心肺復蘇模型的可行性與，為臨床治療提供穩定有效的模型平臺。旨在找到更適合制備心肺復蘇大鼠模型的動物條件，尋求一種穩定性高實用性強的心肺復蘇大鼠模型，為動物模型建立的標準化及進一步深入研究奠定基礎。

本實驗利用4～6 min室顫法制備大鼠心肺復蘇模型，在熟練掌握心肺復蘇模型制作方法的基礎上，考慮月齡較低的年輕大鼠心臟停跳后自身轉復率極高，且立即恢復心跳、血壓的特點，選用了常規實驗用大鼠體重范圍在300 g左右的2月齡大鼠以及4月齡大鼠進行對比研究，發現2月齡組大鼠電刺激致室顫過程中的血壓初始降到88.57±8.52 mmHg并維持在70.71±22.81 mmHg且波動范圍很大，血壓值不能很好地穩定在一個數值上；而4月齡組大鼠的血壓初始降到47.50±5.98 mmHg并在13.50±9.38 mmHg的范圍內平穩維持，我們推測4月齡組大鼠在致顫過程中更好的實現了低血壓維持，同時4月齡組大鼠在低血壓維持的基礎上，更易致顫且能在規定時間范圍內成功復蘇，成模率遠高于2月齡組大鼠。而2月齡組大鼠血壓在致顫過程中始終持續保持在正常血壓值的80%范圍內，直至出現心搏驟停血壓才會驟降到25 mmHg。由此推斷，由于大鼠的生存時間在2～3年，故僅與常規選用的2月齡大鼠而言，只相差2個月的4月齡大鼠，心臟功能存在一定差異，在制備心肺復蘇模型上有一定的優勢，穩定，易操作，可控性強。

本實驗進一步發現：2月齡大鼠與4月齡大鼠相比較： 模型組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的NDS總評分無顯著性差異。而神經功能亞組評分：在網格實驗中4月齡與2月齡大鼠6 h、12 h、24 h、48 h評分有統計學意義而72 h、7 d無統計學意義。在平衡木實驗中6 h、12 h、24 h 4月齡與2月齡大鼠有統計學意義而48 h、72 h、7 d無統計學意義。在懸崖回避實驗中4月齡與2月齡大鼠均無統計學意義。在疼痛刺激實驗中，4月齡與2月齡大鼠6 h、12 h有統計學意義而24 h、48 h、72 h、7 d無統計學意義。根據以上結果推斷：NDS總評分不能夠準確反應大鼠腦損傷的程度，需利用神經亞組評分或發掘其他方法進一步評價神經功能損失。大鼠心肺復蘇后24 h，運動平衡功能缺失的評價中4月齡組大鼠評分顯著低于2月齡組大鼠，感覺功能缺失的評價中，也存在4月齡組大鼠評分顯著低于2月齡組大鼠的現象，此特征進一步提示我們4月齡組大鼠在致室顫過程中的低血壓維持狀態，造成的低灌注狀態，會加重腦損傷程度，從而體現在亞組神經功能評分上；且進行心肺復蘇模型的神經功能缺失評價時，神經功能亞組評分是很有必要的。

參考文獻：

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