豬流產嗜性衣原體病診斷方法研究進展

張文通 魏鳳,2 李峰,2 苗立中,2 沈志強,2

（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬流產嗜性衣原體病診斷方法研究進展

張文通1魏鳳1,2李峰1,2苗立中1,2沈志強1,2

（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬流產嗜性衣原體病是引起母豬流產，產弱胎、死胎的重要傳染病之一，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。正確診斷對防制該病極為關鍵。本文就該病的病原學診斷、血清學診斷、分子生物學診斷方法進行了綜述。

豬流產嗜性衣原體；診斷方法；進展

豬流產嗜性衣原體病的病原是流產嗜性衣原體，該病原能導致母豬流產、公豬生殖道疾病，甚至能導致孕婦感染而引起流產。隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病的感染率有所增加，已受到越來越多從事養(yǎng)豬業(yè)工作者的重視。在國外，Willigan等[1]首先于1955年從患病豬病料中分離到該病的病原；在國內，楊宜生等[2]于1982年首次從流產母豬及患關節(jié)炎仔豬病料中分離到該病的病原。目前，全國大多數(shù)養(yǎng)豬地區(qū)都有關于該病的報道。邱昌慶等[3]、何啟蓋等[4]、羅建等[5]對部分地區(qū)豬血清衣原體陽性率進行了調查研究，發(fā)現(xiàn)該病抗體陽性率普遍很高，說明該病在我國養(yǎng)豬業(yè)中廣泛存在，應引起從業(yè)人員的高度重視。目前該病還沒有有效疫苗可供使用。本文就豬流產嗜性衣原體病的診斷方法進行綜述，旨在為廣大從事養(yǎng)豬生產或研究的工作人員提供參考。

1 病原學研究

1.1 病原的分離培養(yǎng)

病料分離常用的方法是雞胚傳代法和細胞培養(yǎng)法。雞胚傳代法最為常用。將病料（病料采集取自有癥狀或病變部位，比如流產胎兒器官、胎盤和子宮分泌物，患關節(jié)炎的也可采集關節(jié)液）接種于孵化5～7天的雞胚卵黃囊內。對于不能適應雞胚傳代的菌株或初次分離的菌株，建議將病料接種于無特定病原的小鼠或豚鼠。也可將病料接種于McCoy或HeLa229細胞或BHK細胞進行分離培養(yǎng)，但實際工作中因耗時、工作量大等難點并不常用，不適用于大規(guī)模的流行病學調查。

1.2 病原的鑒定

將采自典型部位病料或卵黃囊培養(yǎng)物涂片，Gimenez法染色鏡檢，可見藍綠色、直徑約為0.5～1.4μm小大的圓形產物，部分位于細胞內，大量散布于細胞外，聚集的群體形成網狀小體。也可將病變組織涂片，采用姬姆薩染色法，鏡檢可觀察到菌體呈紫紅色或寶石紅色，直徑大約為0.1～0.6μm，并可觀察到紅色的胞漿內包涵體。直接免疫熒光試驗（IFA）是OIE推薦的診斷方法，有商品化的試劑盒。將熒光標記的多克隆抗體或單克隆抗體滴加到組織抹片或者細胞片，37℃濕盒孵育30分鐘，然后用PBS沖洗3次，自然晾干，在熒光顯微鏡下進行觀察，陽性的可見綠色熒光的包涵體。

2 血清學方法

2.1 間接血凝試驗（IHA）

間接血凝試驗是將抗原（或抗體）包被于紅細胞表面，成為致敏的載體，然后與相應的抗體（或抗原）結合，從而使紅細胞拉聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集反應。該方法在臨床檢驗中已得到廣泛應用。目前市場上已經有產自湖北省農科院畜牧獸醫(yī)研究所和中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所的商品化流產嗜性衣原體間接血凝試劑盒，文獻研究顯示該試劑盒已在全國被廣泛應用于衣原體病的流行病學調查。

2.2 補體結合試驗（CFT）

補體結合試驗是指利用抗原抗體復合物同補體結合，把含有已知濃度補體反應液中的補體消耗掉，使?jié)舛冉档偷默F(xiàn)象，以檢出抗原或抗體的試驗。補體結合試驗是OIE推薦的經典診斷方法，已廣泛用于家畜衣原體病的流行病學調查。但該方法操作步驟過于復雜、需要專業(yè)知識操作，因此在基層應用推廣中受到很大限制。

2.3 間接免疫熒光試驗（IMIF）

間接免疫熒光試驗其染色原理分兩步：第一步，將未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30分鐘，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體；第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體；如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。間接免疫熒光試驗缺陷在于操作步驟繁瑣、特異性差等，不利于實際推廣及應用開發(fā)。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗是酶免疫測定技術中應用最廣的技術，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。間接ELISA法用于測定特異抗體。ELISA方法具有快速、準確、特異、敏感、實用性強等特點。

科研工作者在建立檢測流產嗜性衣原體抗體ELISA方法上做了大量研究工作。1995年Anderson等[6]將衣原體進行純化，將純化后的衣原體原體作為ELISA的包被物，建立了ELISA檢測方法。1996年Griffiths等[7]將純化后的脂多糖抗原（從衣原體表面抗原中提?。┳鳛榘晃铮⒘薊LISA檢測方法，該方法與補體結合試驗同時檢測羊血清，結果表明ELISA方法敏感度高于補體結合試驗。

40 kDa的衣原體主要外膜蛋白（MOMP）具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇，是衣原體病診斷的主要研究抗原。1997年Kaltenboeck等[8]合成衣原體主要外膜蛋白中的部分肽片段，作為包被物，建立了間接ELISA方法，該方法與以其他衣原體抗原作為包被物建立的ELISA方法相比，敏感性更高。同年，Salti-Montesanto等[9]在獲得流產嗜性衣原體單克隆抗體的基礎上建立了競爭ELISA方法。

2001年Buendía等[10]以重組流產嗜性衣原體80～90 kDa蛋白抗原為包被物建立ELISA方法，與以純化的衣原體原體進行包被建立的ELISA方法相比，敏感性更高。2006年Rekiki等[11]制備了以流產嗜性衣原體重組80～90 kDa家族蛋白作為包被原的ELISA試劑盒，但該試劑盒與補體結合試驗符合率只有61.1%，與以純化的衣原體原體進行包被建立的ELISA方法符合率只有65%。

多型性外膜蛋白（POMP）可以產生很高的免疫活性，也常被作為候選抗原用于研制診斷試劑。2007年Mccauley等[12]采用基于POMP90-3、POMP90-4、POMP80-90和MOMP建立的ELISA方法和CFT方法檢測陽性血清；結果表明，敏感性POMP90-3＞POMP90-4＞POMP80-90＞MOMP＞CFT，特異性CFT和POMP90-4＞MOMP＞POMP80-90＞POMP90-3。2009年梅仕林[13]采用以重組流產嗜性衣原體POMP蛋白為包被抗原，建立檢測豬流產嗜性衣原體抗體的間接ELISA方法。特異性研究表明，該方法檢測豬乙腦陽性血清、豬偽狂犬陽性血清、豬瘟陽性血清及豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清均陰性，具有很好的特異性；符合率試驗顯示，該ELISA方法與IHA方法符合率為92.8%。應用該方法調查河南、湖北、安徽及廣東四個省份的豬場，試驗豬群均有豬流產嗜性衣原體感染，陽性率平均在30.7%。

3 分子生物學方法

PCR診斷技術又叫多聚酶鏈式反應技術，它采用分子技術模擬核酸在體內的復制，從而判定疾病病原的種類。PCR技術不需要觀察動物的外觀表現(xiàn)，所以無論是在潛伏期還是暴發(fā)期，只要對動物的相應器官進行檢測，在兩個小時內就能準確判定出畜禽疾病的病原。由于PCR技術具有簡便、快速、靈敏、特異性強等特點，科研工作者運用PCR技術對豬流產嗜性衣原體病進行了大量研究。

1997年Messmer等[14]根據(jù)16s rRNA基因保守序列設計引物，建立了兩步PCR方法，試驗結果表明該方法敏感度遠高于分離培養(yǎng)法。2001年Laroucau等[15]根據(jù)流產嗜性衣原體的pomp基因保守序列，設計引物，建立PCR方法。該方法與RFLP分析方法一起，可以對流產嗜性衣原體種和血清型進行鑒定。2005年Markey等[16]根據(jù)衣原體16s rRNA基因保守序列設計引物，也建立了實時定量PCR方法，通過檢測陽性病料，比較該方法與常規(guī)PCR方法的敏感性，試驗結果表明常規(guī)PCR方法檢測陰性的12份病料，而實時定量PCR方法檢測均為陽性。

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