DNA甲基化在眼科疾病中的應用以及中藥調節甲基化的研究進展

吳文婷 金 明

2003年，伴隨著為期5年的人類表觀基因組計劃（Human Epigenome Project,HEP）正式啟動，醫學界將目光投向DNA甲基化在人類及其他生物的生理狀態以及疾病譜的作用的系統研究方面。經過10年來的迅猛發展，DNA甲基化調節已經成為當今研究熱點，為闡明疾病的發病機制提供了幫助，大量文獻證實特定基因DNA甲基化狀態的異常與眼科疾病密切相關。表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的情況下，基因的表達與功能發生改變并產生可遺傳的表型。DNA甲基化（DNA methylation）作為一種表觀遺傳學的重要機制，是指由DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化 S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，將胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶的反應，此調節在生命活動中發揮重要的作用〔1〕。目前，一些與表觀遺傳學相關的藥物正在臨床試驗中，以期能找到調節表觀遺傳基因組的藥物而達到治療疾病的目的。而前期文獻表明，在胃癌、糖尿病腎病、硬皮病、抗衰老等方面，傳統中醫藥顯示了不可小覷的DNA甲基化調節作用。雖然其在眼科領域的治療還為一片空白，但有理由相信中藥具有通過調節甲基化方面的途徑治療眼科疾病的前景。

1 甲基化在眼科疾病中的應用

1.1 葡萄膜惡性黑色素瘤

1.1.1 RASEF基因：RASEF位于9q21，與葡萄膜、皮膚黑色素瘤相關，起到抑癌基因的作用。Matt〔2〕等以11份葡萄膜黑色素瘤細胞株和35份葡萄膜黑色素瘤組織為研究樣本，用高分辨率熔化曲線及消化分析篩選RASEF變異，RT-PCR測定RASEF表達，基因測序觀察RASEF基因啟動子甲基化狀態。結果表明RASEF啟動子甲基化缺失，伴隨RASEF高表達，且RASEF基因的甲基化與存活率的減少存在關聯。說明葡萄膜黑色素瘤中抑癌基因啟動子甲基化是導致抑癌基因表達沉默、癌癥發生的原因。

1.1.2 hTERT基因：端粒的長短在染色體穩定、細胞生長及衰老方面發揮重要的作用，端粒酶活性異常可使腫瘤細胞具有無限分裂的能力而發生癌變，人催化亞基端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶的限速成分，與端粒酶活性相關，可催化TTAGGG重復序列至染色體末端的端粒，保證染色體在多次復制后，不會被降解〔3〕。Moulin〔4〕等采用甲基化敏感性單鏈構象分析（methylationspecific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）和斑點免疫印跡法，對23例原發葡萄膜黑色素瘤的DNA進行相關基因啟動子甲基化狀態的研究，發現hTERT基因啟動子甲基化的比例為52%。

1.1.3 RASSF1A基因：該基因坐落于3號染色體p21.3區，其編碼的蛋白與DNA修復蛋白XPA相互作用，抑制細胞周期蛋白D1的積累，從而阻滯細胞周期循環。Merhavi〔5〕等采用亞硫酸鈉修飾后甲基化PCR技術對20份原發性葡萄膜黑色素瘤樣本進行研究，發現RASSF1A基因啟動子區存在高甲基化狀態改變，同時與腫瘤相關的BRAF基因變異缺失，說明此腫瘤形成中表觀調節占有重要地位，即抑癌基因啟動子高甲基化的表觀調節可能是葡萄膜黑色素瘤的形成機制。

1.1.4 TIMP3 基因：van der Velden〔6〕將原發性葡萄膜黑色素瘤細胞系和伴肝轉移的細胞系對比研究，采用microarray分析1 176個基因，發現了63個表達異常的基因。再以甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-dC）去甲基化處理原發性葡萄膜黑色素瘤細胞系，發現有19個基因因高甲基化存在表達抑制。其中，金屬蛋白酶組織抑制物-3（tissue metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3）由 TIMP3 編碼，其蛋白產物是參與細胞外基質降解的因子之一，因其DNA高甲基化異常狀態而導致相應蛋白在轉移組織中的表達量下降5倍，表明TIMP3在葡萄膜黑色素瘤的發生，甚至是轉移中發揮重要作用。

1.1.5 p16（INK4a）基因：也被稱為 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A（CDKN2A），為重要的細胞周期依賴性激酶抑制基因，該基因失活可導致細胞G1-S期功能失常，表現為細胞無限制增長，即腫瘤。van der Velden〔7〕發現，在50%的葡萄膜黑色素瘤細胞系以及32%的原發性葡萄膜黑色素瘤中，p16（INK4a)的啟動子存在高甲基化改變，相應蛋白的表達缺失，且伴隨甲基化異常的腫瘤患者死亡率較高。使用5-Aza-dC去甲基化處理樣本后，p16（INK4a）mRNA恢復表達，說明在葡萄膜黑色素瘤中，啟動子的高甲基化導致p16基因表達沉默，甲基化抑制后該基因可重新表達。

1.1.6 CXCR4基因：趨化因子受體CXCR4在體內大部分組織和器官上都有表達，它是由352個氨基酸組成的G蛋白偶聯受體（GPCR），參與體內多種生理機制，如腫瘤遷移等〔8〕。Li〔9〕等為了驗證CXCR4啟動子區甲基化狀態與葡萄膜黑色素瘤肝臟轉移之間的關系，將LS174T克隆腫瘤細胞注射入免疫缺陷小鼠的前房、皮下、脾臟內等誘發肝轉移，檢測發現前房起源的的LS174T腫瘤細胞的CXCR4的表達量相較于其他組和野生型低，其啟動子區（～2660 bp～2671 bp）的DNA幾乎完全甲基化，同時甲基轉移酶活性增高，在加入5-AzadC后，LS174T細胞的CXCR4恢復表達。

1.1.7 TRAIL 受體基因：TRAIL R1-R4（也被稱為 DR4、DR5、DcR1、DcR2）是最主要的4個人類腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,TRAIL）的受體。有文獻表明，DR4啟動子區甲基化可降低葡萄膜黑色素瘤對干擾素介導的凋亡作用的敏感性〔10〕，DcR2在黑色素瘤中蛋白表達沉默〔11〕。 Venza〔12〕等以皮膚、葡萄膜黑色素瘤細胞系以及病理組織為樣本，進行TRAIL受體的啟動子甲基化狀態等方面的觀察。結果表明，在皮膚、葡萄膜黑色素瘤的樣本中，DR4、DR5、DcR1和 DcR2的 DNA啟動子區皆存在明顯異常，但只有DcR1和DcR2的甲基化異常與蛋白表達有相關性，且用5-Aza-dC調節后，蛋白可重新表達。實驗還表明，DNMT1活性與DcR2的高甲基化有關，而DNMT1和DNMT3a共同調節DcR1啟動子區的的甲基化狀態。

1.2 視網膜母細胞瘤

1.2.1 RASSF1A基因：Cohen〔13〕等對 19例視網膜母細胞瘤樣本亞硫酸氫鈉處理后以實時定量甲基化特異性PCR方法進行啟動子甲基化狀態的研究，發現與腫瘤相關的RASSF1A的甲基化率為89%。

1.2.2 Rb2/p130基因：Rb2/p130是與視網膜母細胞瘤相關的抑癌基因之一，由3853個核苷酸構成，含有22個外顯子，位于16q12.2。Rb2/p130可介導與細胞蛋白如轉錄因子E2F、細胞周期蛋白或依賴性激酶相互作用，維持G0期細胞的轉錄靜止，其基因的突變、缺失與許多惡性腫瘤的發生密切相關〔14〕。Tosi〔15〕等對10例視網膜母細胞瘤研究發現，伴隨外顯子1突變，Rb2/p130啟動子CpG區出現甲基化改變，并決定了疾病的表型。用甲基化抑制劑5-Aza-dC處理后，Rb2/p130基因表達水平上升。

1.2.3 MGMT 基因 ：O6-methylguanine DNA methyltransferase（MGMT）基因位于染色體的10q26，為維持基因組的穩定性發揮了重要作用。它可以修復并還原發生甲基化修飾的鳥嘌呤，避免DNA在復制及轉錄時發生錯配及誤差。Choy〔16〕等采用23份視網膜母細胞瘤標本和2份視網膜母細胞瘤細胞株（Y79 and WERI-Rb1）進行與腫瘤相關基因的甲基化狀態的研究。結果表明35%的病理組織中可檢測到至少1處以上的MGMT區的高甲基化，相應蛋白表達缺失，且該情況在低組織分化的瘤體中更常見。從以上推測出，MGMT基因啟動子甲基化后導致MGMT蛋白表達缺失與視網膜母與視網膜母細胞瘤的發生發展緊密相關。

1.3 年齡相關性黃斑變性（AMD）

1.3.1 IL-17RC基因：美國NIH的Wei〔17〕采用甲基化免疫共沉淀芯片技術測定（MeDIP-chip）對3對同卵雙胞胎（其中一個患有AMD，另一人健康）進行研究，發現AMD患者IL-17RC基因啟動子CpG區域存在DNA低甲基化改變。這一結論在多中心收集的大樣本AMD患者中得到驗證。且相較于正常人，IL-17RC在AMD患者的視網膜、脈絡膜組織中高表達，揭示IL-17RC基因啟動子DNA低甲基化以及蛋白高表達是AMD患者所特有的現象。IL-17RC以跨膜蛋白形式存在于細胞膜上，作為共受體與IL-17亞型特異性結合，激活炎癥下游的多條信號轉導通路，影響細胞因子等炎癥相關基因的表達，促進炎癥反應發生。IL-17還能上調血管內皮生長因子（VEGF）的水平〔18〕，增加 VEGF mRNA 的表達。 而 VEGF與肝細胞生長因子（HGF）的聯合作用又可以提供正反饋信號，誘導IL-17RC增多〔19〕，放大了炎癥鏈級反應，形成復雜的炎癥分子網絡。

1.3.2 GSTM1、GSTM5 基因：Hunter〔20〕等借助 Illumina 人類甲基化27平臺，對AMD和健康對照者尸體的視網膜色素上皮（RPE）、脈絡膜進行DNA甲基化的區別檢測，發現與年齡配對的健康人相比，AMD患者的GSTM1啟動子區存在高甲基化改變，導致RPE、脈絡膜以及神經感覺層的 GSTM1和GSTM5的蛋白明顯降低，可能由此引發AMD患者視網膜的氧化應激損傷。

1.4 老年性核性白內障

CRYAA基因：CRYAA編碼一種晶狀體結構蛋白，對于保持晶狀體透明有重要作用。Zhou〔21〕等對15例老年性核性白內障患者的晶狀體上皮細胞研究發現，其啟動子區CpG島存在高甲基化改變，以及相應的轉錄水平、蛋白水平下調。用去甲基化試劑調節后，其表達恢復，提示老年性核性白內障晶狀體上皮細胞存在表觀遺傳調控改變。

1.5 翼狀胬肉

TGM2、MMP2、CD24 基因：Riau〔22〕等從翼狀胬肉患者的病變處和正常結膜處取材，采用亞硫酸鹽測序法比較了29種與基質重構、細胞黏附相關基因的甲基化狀態異同。結果發現，谷氨酰胺轉移酶2（TGM-2）基因有3個CpG位點發生高甲基化改變，基質金屬蛋白酶2（MMP2）和CD24分別存在2個和4個CpG位點的低甲基改變，且轉錄和蛋白水平也發生了相應的調控變化。這3個基因的甲基化異常可導致成纖維細胞、新生血管的病變，從而引發翼狀胬肉的形成。

隨著表觀遺傳學研究的深入，相信在未來，越來越多的眼科疾病將會被證實與基因甲基化狀態異常密切相關。利用基因測序，識別出正常和錯誤的表觀基因組的組成和結構，為運用表觀遺傳學方法來治療疾病奠定了基礎。然而，表觀基因調節藥物仍處于前期開發階段。眾所周知，西藥的研發周期長，需耗費大量的人力、資金，且結果也不一定樂觀。但是，中醫學有寶貴的天然藥材，以及豐富的理論，通過數千年的經驗傳承，已經驗證了臨床有效性，值得后人努力挖掘和證實其現代中藥藥理作用，以更加科學、邏輯的方式去解讀中藥有效性。而現代中醫研究者已經運用表觀遺傳學方法發現中藥對DNA甲基化存在調控作用。雖然，目前中藥調節DNA甲基化的作用在眼科領域鮮有報道，但是有理由認為中藥具有通過調節甲基化而達到治療相關眼病的可能，以下內容就中藥在癌癥、糖尿病腎病、硬皮病、抗衰老等方面調節DNA甲基化的研究進展進行論述，為其將來在眼科的應用提供基礎。

2 中藥調節DNA甲基化的研究進展

黃明明〔23〕等體外培養人胃癌SGC-7901細胞，用不同濃度（0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）白藜蘆醇孵育48 h 后，采用甲基化特異性 PCR（MSP）、RT-PCR、Western blot檢測RASSF1A基因啟動子區域的甲基化改變情況、mRNA表達以及蛋白表達水平。結果顯示白藜蘆醇能以劑量依賴性方式抑制SGC-7901細胞增殖，隨著濃度的增加，RASSF1A甲基化的水平逐漸減弱，非甲基化水平逐漸增多。同時RASSF1A的mRNA和蛋白表達水平明顯上調。提示白藜蘆醇對甲基化水平的調節，可能是其抗癌的重要因素。

硬皮病是表觀遺傳異常的多基因疾病，致病關鍵環節受表觀遺傳調節〔24〕。齊慶〔25〕等體外培養建立硬皮病成纖維細胞系，并用補腎益精法含藥血清干預后，發現補腎益精法可抑制硬皮病成纖維細胞I型膠原α2（Col1α2）、轉化生長因子β（TGF-β）基因的表達，提高膠原抑制因子Fli1與Smad7的表達，同時可減少DNMT1的表達。補腎益精法源自廣州中醫藥大學大學鄧鐵濤教授對硬皮病辨治經驗的總結，能軟化皮膚、改善纖維化表現。補腎益精法軟皮湯方含熟地黃20 g，阿膠、山茱萸各10 g、黃芪、山藥各30 g、紅花5 g、茯苓15 g等。

郭維〔26〕證實，消痰散結方（主要由半夏、天南星組成）能夠有效抑制胃癌細胞系以及裸鼠原位移植瘤的生長，其機制與逆轉抑癌基因p16甲基化水平，增加p16 mRNA表達水平有關。

參茸補血丸由人參、鹿茸、杜仲、巴戟天等藥組成，具有補腎填精、益氣生血的功效，在臨床中廣泛應用。王蕾〔27〕等發現大鼠摘除卵巢后，雌激素分泌障礙，生殖器官萎縮，肝、腎組織甲基化酶活力、甲基化水平升高，對應組織RNA聚合酶活力明顯降低，處于低表達；參茸補血丸大、小劑量組大鼠子宮和陰道組織結構與模型組對比有明顯改善，甲基化酶活力、甲基化水平呈規律性劑量依賴性低下，RNA聚合酶活力明顯提高。說明參茸補血丸能促進去勢大鼠生殖器官的發育，分子機制之一可能是通過降低甲基化水平，提高RNA聚合酶活力，促進相關功能基因表達來實現的。

汪琛穎〔28〕等以糖尿病大鼠為模型，觀察中藥糖維康治療糖尿病腎病的分子機制。其從糖尿病腎病大鼠的胰組織中提取基因組DNA，用甲基化敏感性限制性核酸內切酶HpaII和MspI（為一組同裂酶）進行限制性酶切，并進行染色質DNaseI敏感性分析。研究表明糖維康（太子參、黃芪、玄參、丹參、僵蠶、水蛭等）治療后能向正常方向逆轉胰組織DNA中CCGG位點甲基化狀態，通過提高基因轉錄水平和向正常方向恢復甲基化狀態而發揮其治療作用。

林一萍〔29〕等研究表明益腎健脾方劑能明顯提高生理性腎虛小鼠肝細胞甲基轉移酶的活性，機制可能是通過改變DNA甲基轉移酶空間構象，使它更容易向正常的甲基化位點轉移甲基，為從分子生物學的角度探討中醫益腎健脾延緩衰老的機理提供了客觀依據。

通過以上文獻的分析，中藥主要是在腫瘤領域發揮其DNA甲基化狀態調節作用，通過對甲基化水平的調控，進一步促進抑癌基因表達，降低腫瘤細胞的存活率，從而影響了疾病的發展，相信其調節作用也能應用于葡萄膜惡性黑色素瘤和視網膜母細胞瘤等眼科疾病。此外，對于目前具有調節甲基化作用的中藥進行總結，發現多屬于補腎填精、益氣健脾活血、化痰散結等方面。根據中醫“同病異治”、“異病同治”的經典理論，以上治療法則也在眼科中廣泛運用，且都收效甚好。表觀遺傳學方法的出現，為中藥有效性的研究提供了新的方法。

3 展望與挑戰

DNA甲基化在脊椎動物的生命活動中起重要的調節作用，參與個體發育和細胞分化的過程。與基因序列改變不同，表觀遺傳學修飾是可逆的，這無疑為治療找到了新的突破口。相信隨著研究的深入，在不久的將來，其在眼科疾病研究中的作用會越來越重要。此外，應大力開展中藥有效性的研究，以期能在調節DNA甲基化方面發揮重要作用，更好地服務于臨床。

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