超聲靶向微泡爆破聯合骨髓來源干細胞治療進展

馬 笑，崔可飛

（鄭州大學第一附屬醫院超聲科，河南 鄭州 450052）

骨髓干細胞是多種多向分化潛能的干細胞群的總稱，因其提取方便、倫理爭議小且有多分化潛能的特點，成為治療許多疾病的新手段。然而受到移植效率低下、靶向性差的限制，導致其歸巢率低，難以滿足臨床治療的需要。超聲靶向微泡破壞（Ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）技術是一種極具潛力的靶向給藥新方法[1]。因其無創、靶向性好的特點，能有效提高靶組織局部藥物濃度、提高療效、降低毒副作用，將其與干細胞移植聯合，可顯著提高歸巢率。UTMD技術有希望成為一種新的介導干細胞移植的方法，為進一步治療缺血性疾病另辟新徑。

1 基本概念

骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種來源于骨髓單個核細胞群且具有多向分化潛能的組織干細胞。利用Percoll試劑將骨髓中大部分造血細胞和單個核細胞分離開來，再經過體外貼壁培養，去除懸浮生長的造血細胞，即可獲得較高純度的BMSCs[2]。研究證明，BMSCs具有易于分離和培養、多分化潛能、免疫原性弱、倫理爭議小等優點，所以被認為是最有希望用于治療多種疾病的干細胞[3]。而且BMSCs具有自我更新、多向分化、體外容易培養及能大量擴增的特點[4-5]，在體外有分化為血管內皮細胞的潛能。

骨 髓 單 個 核 細 胞（Bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）為一個細胞群體的總稱，其內含有豐富的干細胞成分，包括造血干細胞/祖細胞、內皮干細胞/祖細胞、多潛能成體祖細胞等。除此之外，BMMNCs中尚含有其它一些功能不明的細胞成分，因而具有多向分化的能力[6]。且提取方法方便快捷，不需培養，取骨髓血用Percoll分離液離心即可獲得，滿足了很多急性疾病對干細胞移植的時機要求，彌補了BMSCs需培養不能立即使用的弊端。現在實驗室多用于治療各種缺血性疾病，如腦梗、心梗、糖尿病足等[7-11]。骨髓干細胞的組成復雜，從免疫組織化學染色可大致分為CXCR4+和CXCR4-兩類。CXCR4+細胞具有趨化作用，可沿著活體病灶釋放SDF-1至血液形成的化學梯度趨化至病灶區域從而發揮局部治療作用。

超聲微泡造影劑是一種小氣泡球體，直徑約1～10 μm，外面裹有脂質、蛋白質及其他大分子物質。當注射到全身時，因為尺寸的限制，他們只存在于脈管系統。內部氣體內核可壓縮的本性導致超聲微泡比周圍血液和組織更有效地散射超聲波，因此，可提高自身顯影。目前，超聲微泡在臨床上主要應用于幾個主要器官中檢測血流灌注，在最近的實驗室研究中用于分子靶向。超聲微泡，雖然過去通常是作為超聲造影劑，但如今因為其特異性靶向攜帶藥物或基因到達病變組織，變得越來越受重視[13-15]。

制備微泡常需將氣體分散到某種特定液體（含能形成外殼以包封氣泡的物質）中，再用探針型聲振儀或高頻震蕩器制備成泡沫，成殼物質移到新的氣-液界面并得以凝聚形成微氣泡外殼。膜的穩定性決定微泡的穩定性，按膜的材料可分為白蛋白、非離子表面活性劑、脂質體、多聚體。按發展可分為四代，第一代微泡內為自由氣泡，以空氣和氧氣為主要成分，大小不一，穩定性差，且外膜無穩定劑，不能通過肺循環。第二代微泡成分是空氣，外殼為人體白蛋白，但由于微泡殼厚、易破等缺點，故不夠穩定、諧振能力差。第三代微泡外殼為脂質成分，氣體內核為低溶解性、低彌散性的高分子量的氟硫氣體，顯著提高了微泡的穩定性，直徑一般為1～8 mm，小于人體紅細胞，因而可經外周靜脈注射后自由通過肺循環，最終到達靶器官或者靶組織，從而實現回聲增強（如現在常用的聲諾維（SonoVue），是目前較為理想且應用較廣的聲學造影劑），廣泛應用于實驗室研究以及臨床對肝內腫塊的診斷。但此種微泡僅用于超聲造影，提高常規超聲對腫塊內血管的辨識度、靈敏度，并不能用于治療，更不具有靶向性，且因為尺寸的限制，不能通過血管，僅作為血池內造影劑。目前，有研究報道第四代微泡，它的直徑更小，趨于納米級，且在第三代微泡的基礎上進行靶向修飾，即將配體粘附于微泡的表面，通過血液循環聚集到特定的組織或器官，然后選擇性地與相應受體結合，使靶區域超聲信號增強，從而達到靶向診斷與治療的目的。不同于普通微米級微泡，納米級微泡靶向性好，且背景不增強，提高了病灶的診斷率。此種微泡一經提出立即成為研究的熱點，國內外學者相繼用各種方式制作各種靶向性微泡，以期為臨床診斷和治療提供新途徑[16]。

2 UTMD聯合干細胞作用機制

UTMD聯合干細胞治療缺血性疾病的主要機制是將附有干細胞的超聲微泡造影劑或直接將干細胞、微泡相繼經外周靜脈注射進入全身血液循環，后在靶區以一定聲強的超聲照射，因血液中的超聲微泡具有一定的可壓縮性，即微泡特有的先后產生不對稱的“壓縮-膨脹”性能，使聲場中的微小氣泡會隨著聲波不斷振動、膨脹、收縮，從而誘導發生空化效應[17]。利用空化效應產生的微射流和沖擊波的機械損傷在細胞的質膜或核膜上出現了暫時性小孔（聲孔效應），使細胞外藥物和基因通過小孔進入細胞內[18-19]，從而使細胞通透性增高，進而使攜帶的或血液中的干細胞進入缺血細胞內，增加歸巢率，從而發揮干細胞的多向分化及旁分泌功能，以改善缺血灶的血流灌注，從而在降低干細胞副作用的基礎上提高療效[20]。

微泡的靶向作用可通過主動靶向、被動靶向兩方面實現：①主動靶向——微泡自身的靶向作用。現國內外學者均著重于此類靶向微泡的研制。王朝清等[21]用生物素-鏈霉親和素系統成功將普通注射用SonoVue構建為靶向微泡；王紅紅等[22]在共價結合與靜電吸附的協同作用下，制備出一種新型載藥超聲微泡；趙敏等[23]用靜電吸附法將淋巴細胞選擇素（Lymph-Selectin，L-S）鏈接到脂質超聲微泡膜表面，制備成L-S靶向超聲微泡；Unger等[24]報道用特異性寡肽和MRX408脂質微泡結合，可制備血栓靶向微泡，通過與血栓內GPIIb/Ⅲa受體結合鑒別新鮮與陳舊性血栓。盡管這些微泡尚處于實驗室研究方面，未用于臨床治療，但這種靶向微泡的研制方法已給我們啟示，指導我們今后制作出各種靶向性好的微泡。②被動靶向——靶向部位的超聲輻照。在特定部位的靶區給予一定功率的超聲輻照，該處血管內微泡破裂產生空化效應，以致特定部位的血管內膜間隙增大，增加了治療藥物的通透性。此種方式（即UTMD技術）也廣泛應用于實驗室研究中[25-26]。

3 應用

超聲微泡造影劑最早于1968年由Gramiak首次報道應用，現已有40余年歷史。它能有效增強活體的二維和多普勒超聲信號，顯著提高超聲診斷的敏感性和特異性[27]。近些年，隨著第四代微泡的報道，人們發現超聲微泡不僅是一種良好的超聲顯像對比劑，更是一種重要的藥物遞送載體，實現靶向給藥的目的。超聲微泡給臨床提供了一種靶向給藥的新途徑，有望解決常規藥物缺乏靶向性、副作用大、療效差的難題，成為疾病治療研究的重點[28]。超聲微泡造影劑應用在治療疾病的領域，其中介導藥物轉染成為研究的熱點，目前超聲微泡造影劑已被公認為一種新興的載體介導基因轉染。

Zen等[29]利用UTMD聯合BMMNCs治療缺血性心肌病的倉鼠模型，結果發現，實驗組倉鼠缺血心肌的毛細血管密度和心肌血流量均較對照組明顯增加，從而證明該法可抑制心肌重構，阻止心衰的進展。Xu等[30]利用超聲輻照靜脈注射的微泡和BMSCs，通過與對照組比較發現實驗組兔的心功能明顯改善，心肌毛細血管數量增多，心肌纖維化的面積縮小，說明UTMD促進了BMSCs的歸巢，進而發揮了治療作用。Song等[31]將UTMD與BMSCs聯合，使靶向到達心肌組織的BMSCs增多，從而改善梗死心肌的功能。Enomoto等[32]將大鼠后肢缺血模型分為對照劑組、超聲輻照組、骨髓干細胞移植組，結果發現細胞移植組新生血管計數等優于對照劑組、超聲輻照組，且超聲輻照組、對照劑組之間差異無統計學意義，說明超聲輻照本身并無治療作用；隨后他又將后肢缺血模型分為對照劑組、細胞治療組、細胞治療聯合超聲輻照組，發現細胞治療聯合超聲輻照組療效遠優于單純細胞治療組，說明UTMD聯合干細胞治療可顯著改善單純干細胞的促進血管新生的作用。Chappell等[33]將倉鼠心肌病模型分為超聲+微泡+BMMNCs組、超聲+微泡組、超聲+BMMNCs（無微泡）組、單純對照劑組，12周后分析心肌樣本發現，超聲+微泡+BMMNCs組微血管內有標記的BMMNCs定植，且此組的毛細血管密度、血液灌注、毛細血管內粘附因子（VCAM-1和ICAM-1）的表達、心肌內VEGF和bFGF的含量均較對照組明顯升高，心功能顯著改善，心肌纖維化的范圍和凋亡細胞的數量明顯降低，說明UTMD聯合BMMNCs可促進BMMNCs的靶向傳遞，從而提高了新生血管的密度和局部血流，抑制心肌重塑，從而阻止了心衰的發生。由此，推測這種非侵入性的細胞傳遞系統可能是一種新的有效的促使心肌病新生血管生長的細胞治療方法。

4 問題和展望

近幾年國內外針對載藥超聲微泡的研究已取得了許多重要進展。藥物制劑的研究已進入靶向給藥系統（Targeted drug delivery system，TDDS）時代。而UTMD技術即為一種極具潛力的靶向給藥新方法[26]，相對于常用的病毒轉染，它具有免疫反應小、操作方法簡單、無病毒感染風險的優點[34-35]。但有些問題仍待解決：①超聲微泡的安全性，在穩定狀態時已有少量微泡破裂，造成對組織損害。②靶向微泡的制備方法尚未有定論，在體內實驗因體內參與靶向微泡的粘附素各不相同，難以評價其特異性及粘附效能。③超聲設備、參數意見尚未達成共識[36-38]，對適宜的超聲強度劑量還在摸索階段，未有定論，過大劑量可對組織造成損傷。④微泡濃度增加，促進造影效果的同時也加大了對機體損傷的風險。如何權衡造影效果與副反應風險之間的平衡點需要摸索。⑤UTMD和干細胞移植的作用機制尚未完全明確，有待進一步研究闡述。⑥UTMD和干細胞移植具有各自的優點和局限性，如何將這些治療方法更有效的相結合值得進一步探索。

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