Nrf2在酒精性肝損傷模型中的研究進展

邢會杰，宋琳亮，方梅霞，和 君，李守軍，傅江南

(1. 暨南大學實驗動物管理中心，廣州 510632; 2. 華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

肝臟是徑口攝入的外源性毒物在小腸吸收后首先被暴露的器官，是機體執行解毒和代謝自穩態功能的主要位點[1]。肝臟也是酒精在體內代謝的特異性器官[2]。酒精消費與多達60多種疾病相關，在美國，每年因慢性肝病死亡的26000人中，其中有46%與酒精濫用或酗酒有關[3]。酒精在肝臟代謝過程中產生的氧化應激是引起酒精性肝損傷的主要因素，酒精刺激肝臟發生氧化應激時，為了維持機體的氧化還原平衡，一系列抗氧化蛋白如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及谷胱甘肽還原酶參與反應，清除過多的氧化應激產物，它們的共同作用保護了細胞和組織免受氧化應激損傷。一旦體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)等產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷[4]。核轉錄因子NF-E2相關因子2 (nuclear factor-erythroid-related factor 2, Nrf2) 是在肝臟中調節一系列解毒和抗氧化防御基因表達的必須轉錄因子，是體內調節氧化應激的關鍵靶點，其可以通過促進多種Ⅱ相抗氧化酶和解毒酶的表達，發揮重要的抗氧化作用，是目前發現的細胞抗氧化應答的核心途徑之一，能夠顯著誘導機體的內源性抗氧化應答[5-7]。在氧化應激情況下，Nrf2可與抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)結合介導它的目的基因表達[8]。本文將對Nrf2的分子結構，激活和降解，分子調控機制以及在酒精介導的肝臟氧化應激中的作用進行綜述。

1 Nrf2概述

1.1 Nrf2分子結構

Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，屬于CNC (Cap‘n’collar) )轉錄因子家族中活力最強的轉錄調節因子[9]，Nrf2的分子結構包含Neh1-6區，這些區在不同物種間高度保守[10-11]。其中，Nehl區是bZipDNA結合區，Nrf2通過Nehl區與Mafs發生相互作用，并與DNA形成異二聚體。Neh2區介導Nrf2與胞質抑制因子Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)的結合。Neh3區位于Nrf2羧基末端，對于Nrf2下游多種抗氧化反應元件ARE依賴性基因的轉錄激活具有重要作用。Neh4和Neh5區共同結合另一種轉錄共激活因子CBP，參與Nrf2轉錄活性的調控。Neh6區目前被認為是一種Keapl非依賴性的Nrf2負性調控區域，參與Nrf2的降解[12]。

1.2 Nrf2的激活和降解

在正常生理自穩態狀態下，Nrf2的激活依賴于Keap1, Nrf2和Keap1在細胞質內形成復合體處于抑制狀態，并通過Keap1介導的泛素化對Nrf2持續進行降解以維持轉錄形成的Nrf2之間的平衡[13]。當機體受到氧化應激或親電子基團刺激時，Keap1介導的泛素化被阻止，導致Keap 1的構像發生改變，使Nrf2從Keap l上解耦聯，Nrf2核轉位水平升高，游離的Nrf2進入核內，與下游目標基因的ARE結合并介導目標基因的轉錄表達，從而激活Nrf2信號通路[14-15]。在氧化還原平衡恢復之后，Nrf2轉回入胞漿并通過泛素化降解，促進Nrf2的消耗，使Nrf2維持到正常水平[16-17]。過去幾十年的研究證據表明CNC轉錄因子家族的另外一個轉錄因子Bach1也可以激活Nrf2，生理狀態下，Bach1結合到ARE啟動子區域阻止Nrf2的結合[18]。在應激狀態下，Bach1被Nrf2取代，導致Nrf2激活，這說明在不同細胞狀態下，Bach1與Nrf2可競爭性結合到同一基因結合位點[19]。

1.3 Nrf2主要目標基因

作為對氧化應激或親電子基團刺激的反應，Nrf2轉位入核和Maf形成異二聚體后與ARE結合通過上調下游抗氧化目標基因的轉錄控制著細胞的命運，而這些目標基因的最主要特點是在其啟動子區域都含有ARE序列。 Nrf2可介導多種細胞保護和解毒基因的轉錄激活發揮功能，其調控的下游目標基因[20-24]主要包括 谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteineligase, GCL)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)，硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)，硫氧還蛋白還原酶 (thioredoxin reductase, TrxR)，過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin, Prx)和血紅素單加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)等氧化還原平衡蛋白，具有保持細胞內谷胱甘肽和 硫氧還蛋白水平以及降低ROS水平的功能；谷胱甘肽-轉移酶 (Glutathione-S-transferase, GST)，NAD(P)H：醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase-1, NQO1)和葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)等II相解毒酶，在體內主要發揮降解外源性毒物轉化為無毒物質和催化結合反應提高外源性毒物的水溶性以利于消除的作用；和多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)等轉運蛋白，可以控制內源性底物和外源性毒物的吸收和排出。

2 Nrf2的分子調控機制

Keapl即是氧化物和親電子物質誘導Nrf2活化的化學感受器，也是泛素-蛋白酶系統介導Nrf2降解的調節器，在Nrf2信號通路的分子調控機制中居于核心地位[22]。生理狀態下，Keap l作為cullin 3 (Cul3)-Rbxl-E3泛素連接酶與底物Nrf2的連接分子，不斷對Nrf2進行泛素化和蛋白酶體降解，此時細胞的Nrf2低水平表達[25]。當機體在氧化應激或親電子物質刺激情況下，Nrf2通過與Keapl蛋白上的關鍵半胱氨酸殘基發生化學反應，使Keapl-Cul3-Rbxl-E3復合體分離，從而抑制Nrf2泛素化，并增強Nrf2蛋白的穩定性，Nrf2呈高水平表達并轉移入核發揮作用。當機體自穩態恢復，Keapl從胞漿中穿梭進入細胞核，從ARE上移走Nrf2，然后Nrf2-Keapl復合物再次移位出核轉入細胞質中，Nrf2-Keapl復合物則再次通過Cul3-Rbxl-E3依賴性泛素酶機制降解。Nrf2重新保持低水平表達，Nrf2信號通路被抑制[22]。研究發現，包括細胞外信號調控酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，磷酸肌醇激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)，蛋白酶C (protein kinase C, PKC)等激酶通路均參與Nrf2的分子調控，其機制是蛋白激酶能通過直接磷酸化Nf2的方式促使其與Keap1分離，激活Nrf2的轉錄和表達[26]。另外，Bach1通過與Nrf2競爭性結合ARE啟動子區域位點達到對Nrf2的調控，這被認為是Nrf2通路的一種新的反饋抑制調節機制[19]。

3 Nrf2在酒精性肝損傷模型中的作用

Nrf2是否在酒精介導的肝臟氧化應激損傷中起主要作用尚不完全清楚，對Nrf2的研究結論中尚存在相互矛盾的觀點。多數認為Nrf2的激活在對抗酒精介導的肝臟氧化應激中具有重要作用。在體動物實驗利用Nrf2基因缺陷小鼠飼喂一定劑量的酒精后與野生型小鼠相比增加了肝臟相關疾病的致死率，并認為酒精對Nrf2基因缺陷小鼠的不利效應是由于脂肪生成的增加，總谷胱甘肽和線粒體谷胱甘肽的耗竭和庫弗氏細胞介導的炎癥反應的加劇的綜合結果[27]。離體實驗利用siRNA技術，對Nrf2基因進行干擾后發現，酒精介導的肝臟氧化應激和脂質過氧化水平明顯升高[28]，另外，在用酒精孵育人類肝細胞實驗中表現出酶釋放提高，GSH耗竭和脂質過氧化水平的上升。也證實了Nrf2具有保護肝細胞避免酒精介導的氧化應激損傷的作用[29]。胎兒酒精綜合癥是酒精濫用的主要毒副效應，近來利用待孕母鼠給予酒精飼喂實驗[30]發現，可明顯提高小鼠胚胎中Nrf2蛋白和Nrf2-ARE結合，并伴隨著多種Nrf2下游目標抗氧化基因和蛋白如SOD1、SOD2、SOD3、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶中等程度的升高[31]。以上諸多結果表明，Nrf2在避免酒精介導的肝臟氧化應激損傷中具有重要保護作用。

然而，也有與以上相反的研究結果認為，機體在酒精介導的肝臟氧化應激損傷保護中，HO-1作為抗氧化防護因子具有關鍵性作用，其具體機制是在酒精介導肝臟氧化應激損傷期間HO-1是依賴Nrf2被激活后發揮抗氧化應激損傷作用的。這一觀點在大鼠給予酒精實驗中發現Nrf2在肝臟的表達下降得到證實，同時研究認為另外一個AREs的調控子ATF4可能是上調氧化應激保護基因的主要機制[32]。Yeligar等[33]也認為酒精介導的HO-1并不主要是由庫弗氏細胞中的Nrf2調控的，他們指出HO-1在給予酒精的大鼠模型中主要是由枯否氏細胞中的低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α)調控的，同時指出HO-1的上調阻止了酒精介導的肝損傷中炎性因子的過量形成而對肝細胞氧化應激損傷起到保護作用。

4 結語

目前的研究已經明確，Nrf2信號通路是在生物體抵御外源性刺激和毒物的適應性保護反應中具有重要作用。雖然Nrf2在酒精性肝臟氧化應激損傷中是否起主要保護作用尚有爭議，但至少可以確定的是酒精介導的肝損傷氧化應激水平與Nrf2基因具有相關性，關于酒精性肝病研究中對Nrf2基因的研究還處于初期階段，接下來還有很多關于Nrf2在酒精性肝病中未知問題需要進一步研究加以證實。但越來越多的研究表明，Nrf2在涉及氧化應激損傷的人類多種疾病中具有重要的細胞保護作用，隨著對Nrf2研究的進一步深入，對Nrf2分子的功能、激活方式、目標底物、分子調控機制和在疾病中的生物學作用等方面的了解和認識也會進一步加強，并為其在生物學等領域的機理研究、以及預防和干預治療與之相關的疾病開辟新途徑。

參考文獻：

[1] Shin SM, Yang JH, Ki SH. Role of the Nrf2-ARE pathway in liver diseases [J]. Oxid Med Cell Longev,2013:763257.

[2] Wu KC, Liu J, Klaassen CD. Role of Nrf2 in preventing ethanol-induced oxidative stress and lipid accumulation [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 262(3):321-329.

[3] Yoon YH, Yi H. Liver cirrhosis in the United States, 1970-2007 surveillance report #88. 2010. NIAAA homepage. http://pubs.niaaa.nih.gov/publications/surveillance88/Cirr07.htm

[4] Lu SC, Mato JM. Role of methionine adenosyltransferase and S-adenosylmethionine in alcohol-associated liver cancer [J]. Alcohol, 2005, 35(3):227-234.

[5] Copple IM. The Keap1-Nrf2 cell defense pathway - a promising therapeutic target? [J]. Adv Pharmacol, 2012, 63:43-79.

[6] Lewis KN, Mele J, Hayes JD, et al. Nrf2, a guardian of healthspan and gatekeeper of species longevity [J]. Integr Comp Biol, 2010, 50(5):829-843.

[7] Magesh S, Chen Y, Hu L. Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents [J]. Med Res Rev, 2012, 32(4):687-726.

[8] Mathers J, Fraser JA, McMahon M, et al. Antioxidant and cytoprotective responses to redox stress [J]. Biochem Soc Symp, 2004, (71):157-76.

[9] Yu X, Kensler T. Nrf2 as a target for cancer chemoprevention [J]. Mutat Res, 2005, 591(1-2):93-102.

[10] Kobayashi M, Yamamoto M. Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant gene regulation [J]. Antioxid Redox Signal. 2005, 7(3-4):385-94.

[11] Lee JM, Li J, Johnson DA,etal. Nrf2, a multi-organ protector?[J]. FASEB J. 2005,19(9):1061-6.

[12] Baird L, Dinkova-Kostova AT.The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway[J]. Arch Toxicol., 2011,85(4):241-72.

[13] Rushworth SA, Macewan DJ. The role of Nrf2 and cytoprotection in regulating chemotherapy resistance of human leukemia cells [J]. Cancers (Basel), 2011, 3(2):1605-1621.

[14] Huang HC, Nguyen T, Pickett CB. Phosphorylation of nrf2 at ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription [J]. J Biol Chem, 2002, 277(45):42769-42774.

[15] McMahon M, Itoh K, Yamamoto M, et al. Keap1-dependent proteasomal degradation of transcription factor nrf2 contributes to the negative regulation of antioxidant response element-driven gene expression [J]. J Biol Chem, 2003, 278(24):21592-215600.

[16] Giudice A, Arra C, Turco MC. Review of molecular mechanisms involved in the activation of the Nrf2-ARE signaling pathway by chemopreventive agents [J]. Methods Mol Biol. 2010, 647:37-74.

[17] Itoh K, Mimura J, Yamamoto M. Discovery of the negative regulator of Nrf2, Keap1: a historical overview [J]. Antioxid Redox Signal, 2010, 13(11):1665-1678.

[18] Shan Y, Lambrecht RW, Donohue SE, et al. Role of Bach1 and Nrf2 in up-regulation of the heme oxygenase-1 gene by cobalt protoporphyrin [J]. FASEB J, 2006, 20(14):2651-2653.

[19] Kaspar JW, Jaiswal AK. Antioxidant-induced phosphorylation of tyrosine 486 leads to rapid nuclear export of bach1 that allows nrf2 to bind to the antioxidant response element and activate defensive gene expression [J]. J Biol Chem, 2010, 285(1):153-162.

[20] Reisman SA, Csanaky IL, Aleksunes LM, et al. Altered disposition of acetaminophen in nrf2-null and keap1-knockdown mice[J]. Toxicol Sci, 2009, 109(1):31-40.

[21] Long DJ 2nd, Gaikwad A, Multani A, et al. Disruption of the nad(p)h:quinone oxidoreductase 1 (nqo1) gene in mice causes myelogenous hyperplasia [J]. Cancer Res, 2002, 62(11):3030-3036.

[22] Rushworth SA, Chen XL, Mackman N, et al. Lipopolysaccharide-induced heme oxygenase-1 expression in human monocytic cells is mediated via nrf2 and protein kinase C [J]. J Immunol, 2005, 175(7):4408-4415.

[23] Chi L, Ke Y, Luo C, et al. Depletion of reduced glutathione enhances motor neuron degeneration in vitro and in vivo [J]. Neuroscience, 2007, 144(3):991-1003.

[24] Jung KA, Kwak MK. The Nrf2 system as a potential target for the development of indirect antioxidants [J]. Molecules, 2010, 15(10):7266-7291.

[25] Furukawa M, Xiong Y. BTB protein Keap1 targets antioxidant transcription factor Nrf2 for ubiquitination by the Cullin 3-Roc1ligase [J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(1):162-171.

[26] Zhang H, Forman HJ. Acrolein induces heme oxygenase-1 through pkc-delta and pi3k in human bronchial epithelial cells [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008,38(4):483-490.

[27] Lamlé J, Marhenke S, Borlak J, et al. Nuclear factor-eythroid 2-related factor 2 prevents alcohol-induced fulminant liver injury [J]. Gastroenterology, 2008, 134(4):1159-1168.

[28] Gong P, Cederbaum AI. Nrf2 is increased by CYP2E1 in rodent liver and HepG2 cells and protects against oxidative stress caused by CYP2E1 [J]. Hepatology, 2006, 43(1):144-153.

[29] Yao P, Nussler A, Liu L, et al. Quercetin protects human hepatocytes from ethanol-derived oxidative stress by inducing heme oxygenase-1 via the MAPK/Nrf2 pathways [J]. J Hepatol, 2007, 47(2):253-261.

[30] Abu-Bakar A, Satarug S, Marks CG, et al. Acute cadmium chloride administration induces hepatic and renal CYP2A5 mRNA, protein and activity in the mouse: involvement of transcription factor NRF2 [J]. Toxicol Lett, 2004, 148(3):199-210.

[31] Dong J, Sulik KK, Chen SY. Nrf2-mediated transcriptional induction of antioxidant response in mouse embryos exposed to ethanol in vivo: implications for the prevention of fetal alcohol spectrum disorders [J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(12):2023-33.

[32] Bardag-Gorce F, Oliva J, Lin A, et al. Proteasome inhibitor up regulates liver antioxidative enzymes in rat model of alcoholic liver disease [J]. Exp Mol Pathol, 2011, 90(1):123-130.

[33] Yeligar SM, Machida K, Kalra VK. Ethanol-induced HO-1 and NQO1 are differentially regulated by HIF-1alpha and Nrf2 to attenuate inflammatory cytokine expression [J]. J Biol Chem, 2010, 285(46):35359-35373.