中性粒細胞絲氨酸蛋白酶及其抑制劑與炎癥

鄧 振，何慶豐，彭禮飛，

（1.廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；2.廣東醫學院寄生蟲學與臨床寄生蟲檢驗學教研室，廣東湛江 524023）

中性粒細胞絲氨酸蛋白酶（neutrophil serine proteases，NSPs）是在中性粒細胞中表達的蛋白水解酶，正常生理情況下儲藏于胞質顆粒中，包括中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶 G（cathepsin G，CG）、蛋白酶 3（proteinase 3，PR3）以及中性粒細胞絲氨酸蛋白酶4（neutrophil serine proteinase 4，NSP4）。當機體發生組織損傷或病菌感染時，中性粒細胞激活并發生脫顆粒作用，NSPs被釋放至細胞外，進而在機體急性感染、炎癥、組織損傷或壞死、急性溶血和失血、急性中毒以及惡性腫瘤等情況時發揮著重要作用；而中性粒細胞的異常激活引起的過量NSPs也會通過水解其特異性底物而直接導致組織損傷，并參與多種器官的炎癥反應［1］，可能是炎癥反應中各種原因導致組織損傷的共同通路。本文就NSPs及其抑制劑對炎癥反應的調控作用進行綜述。

1 中性粒細胞絲氨酸蛋白酶的生物學功能

1.1 彈性蛋白酶 中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）儲存于中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒中或表達在被細胞因子初次激活的細胞表面。其作用底物廣泛，包括幾乎所有的細胞外基質蛋白及多種可溶性蛋白，但最適底物為彈性蛋白。NE參與構成機體防御系統，可以協助清除異源性物質、參與調節炎癥反應和促進吞噬細胞消除有害病菌，因此NE是機體受到威脅的重要保護介質，但同時過度的NE激活也會引起機體損傷和炎癥反應的發生。

正常生理條件下，當機體組織受到有害物質入侵時，中性粒細胞便在局部聚集、激活并脫顆粒，釋放出不超過總量2%的NE分解胞外基質，從而使得中性粒細胞順利通過血腦屏障進入炎癥部位，并通過細胞吞噬作用殺死和溶解致病微生物。但在疾病條件下，中性粒細胞的過度激活可釋放出多達總量12%的NE到達細胞表面［2］，NE的過度富集不僅可以降解細胞外基質、增加組織通透性、促進中性粒細胞滲出及向炎癥部位趨化集中，釋放IL-8、TNF-α等炎癥因子促進炎癥反應，而且可以催化caspase-3誘導的細胞凋亡，進而引發機體多種炎癥相關疾病［3］。

1．2 組織蛋白酶G 組織蛋白酶G（CG）存在于中性粒細胞顆粒中并從炎癥部位釋放，能殺死、降解病原體，重組組織，并激活促炎癥細胞因子和受體；也有研究發現CG存在于一系列抗原遞呈細胞的胞吞囊泡內，能參與MHCⅡ的抗原遞呈過程，而且CG能通過胞吞作用進入原本不表達的細胞，擴大其發揮抗原提呈作用的細胞范圍［4］。更多的研究表明，CG不僅在水解胞外基質及免疫應答中具有重要作用，而且在細胞凋亡、趨化作用和凝血過程中具有重要作用［5］。

1．3 蛋白酶3 蛋白酶3（PR3）主要儲存在中性粒細胞的嗜天青顆粒和單核細胞的過氧化物酶陽性溶酶體中，受到炎癥刺激時可以在細胞表面表達。雖然PR3與NE都屬于NSPs，序列相近性和亞基相似度較高，但它們卻有不同的生物學功能。PR3的細胞內特異性亞基使其可以參與細胞增殖和凋亡的調控，而它作為膜表面蛋白又與急性炎癥反應密切相關，同時還是抗中性粒細胞胞質抗體（ANCA）的主要靶抗原之一，在許多自身免疫性疾病的臨床檢測中具有重要意義［6］。

1．4 中性粒細胞絲氨酸蛋白酶4 NSP4是繼NE、CG及PR3之后在中性粒細胞中發現的第4種絲氨酸蛋白酶，它是于2012年由Perera等［7］發現并命名的。NSP4存在于中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒中并在激活狀態下釋放，分子質量較低，在脊椎動物中高度保守，結構上與NE和PR3相似性高達39%［7］；但由于NSP4含量很少，約為CG含量的5%，所以其研究一直以來都被忽略了，相關報道也極為少見。有研究發現，NSP4敲除的小鼠在無病原菌生存條件下未表現出任何異常，故其主要在病原微生物入侵過程中起到一定的防御作用［8］。

2 中性粒細胞絲氨酸蛋白酶調控炎癥反應

中性粒細胞的免疫位點被激活后，大量NSPs被釋放到細胞外環境中，一部分釋放出的蛋白酶結合在質膜外表面上并保持著一種激活狀態，所以可溶性NSPs和膜結合NSPs都可以發揮蛋白水解活性，調控多種趨化因子、細胞因子、生長因子和細胞表面受體的活性。同時，分泌出的蛋白酶還可以激活淋巴細胞和粘附分子，進一步調控免疫應答和炎癥反應。

由于一直以來研究較多的NSPs主要為NE、CG和PR3，而NSP4是最近才發現的，相關研究極少，故此處總結了這3種最主要的NSPs與炎癥反應的研究情況。

2.1 彈性蛋白酶 彈性蛋白酶與多種氣道疾病密切相關，并調節促炎癥因子的釋放，參與炎癥反應。支氣管擴張是一種慢性肺部炎癥疾病，與病原菌感染、免疫缺陷和自身免疫系統紊亂有關。Chalmers等［9］的研究發現支氣管擴張炎癥與中性粒細胞密切相關，中性粒細胞可在多種促炎因子作用下遷移到氣道部位抵抗病原菌侵害和炎癥反應，然而NE可以通過剪切吞噬細胞受體和激活的補體而抑制中性粒細胞的作用進而導致炎癥發生。慢性阻塞性肺疾病是被世界衛生組織認定為引起疾病死亡的第四大因素，Lucas等［10］的研究表明，NE是在慢性阻塞性肺疾病炎癥反應過程中作用最為重要的一種絲氨酸蛋白酶，30多年以前就是慢性阻塞性肺疾病的治療靶點，蛋白酶－抗蛋白酶的平衡失調可導致胞外NE激增，尋求有效的低分子量NE抑制劑具有重要的研究意義。慢性阻塞性肺疾病的急性惡化中，NE釋放量增多是一個極為明顯的變化，Hoenderdos等［11］的研究中發現包括NE在內的NSP是慢性阻塞性肺疾病組織損傷的關鍵調控因素，與炎癥反應密切相關。有研究表明NE可以通過上調核轉錄因子-κB（NF-κB）和激活因子蛋白-1（activator protein 1，AP-1），促進IL-8的合成和釋放，促進炎癥反應的發生和發展［12］。

2．2 組織蛋白酶G 組織蛋白酶G與潰瘍性疾病、急性炎癥反應密切相關，甚至參與了惡性腫瘤如肺癌的發病過程。在中性粒細胞黏合到免疫復合物上的過程中，CG與細胞表面整聯蛋白相互作用，促進整聯蛋白聚合、細胞支架重排和隨后的中性粒細胞趨化因子的釋放，進而促進炎癥反應過程的發生［5］。Dabek等［13］的研究發現CG與潰瘍性結腸病有關。CG存在于潰瘍性結腸病人的結腸腔中，可以通過激活位于腸上皮細胞頂側的蛋白酶激活受體-4（PAR-4）而導致上皮屏障破壞，促進炎癥反應。

2．3 蛋白酶3 蛋白酶3作為抗中性粒細胞胞質抗體的主要靶抗原，參與了許多自身免疫性疾病和炎癥反應的調控。細胞外的PR3通過N-末端剪接使中性粒細胞和內皮細胞釋放IL-8并產生趨化因子，促使中性粒細胞被招募到炎癥部位；同時PR3作為促TNF-α因子的轉化酶，可以促進膜結合的潛在促炎癥因子TNF-α的轉化，促進炎癥反應［14］。中性粒細胞表面的膜結合PR3是韋氏肉芽腫病的抗中性粒細胞胞質抗體的首要抗原靶標。Arias-Loste等［15］發現PR3也參與了炎性腸病的發生發展過程，他們的研究通過檢測142個血清標本發現抗PR3-抗中性粒細胞胞質抗體可以作為炎性腸病的血清學標記。Kwon等［16］于2013年的研究發現PR3也參與了過量中性粒細胞進入腦部引起的神經炎癥的發病過程，蛋白酶處理原代培養的大腦皮層神經元可以明顯誘導活性氧分子的產生、降低總谷胱甘肽含量、阻斷線粒體膜電位、促進細胞凋亡以及誘導神經元死亡，這說明PR3在神經炎癥的發病及調控過程中具有重要作用。

3 中性粒細胞絲氨酸蛋白酶抑制劑對炎癥反應的防治作用

3.1 內源性中性粒細胞絲氨酸蛋白酶抑制劑 中性粒細胞胞質中含量很高的SerpinB1可以有效地抑制NSPs的活性，參與炎癥反應的調節；人體肝臟也可以產生內源性的NSP抑制劑，如 α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-PI）及 α-巨球蛋白（α-macroglobulins），它們隨血液和細胞間液在機體中循環游走，以有效中和機體釋放出的過量NSPs的作用；另外，還有一些組織特異性的NSPs抑制劑，如（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）和 elafin，這兩者可以有效調節細胞間液蛋白酶的活性。這些內源性抑制劑通常是對幾種NSP或其他蛋白酶同時具有抑制作用。

SerpinB1在所有的骨髓白細胞中表達，甚至包括干細胞和祖細胞。它可以有效地抑制NSPs的NE、CG和PR3的活性。Gong等［17］的研究表明SerpinB1可以通過抑制NSPs的活性以及減少促炎癥因子 TNF-α、IL-6、KC／CXCL1、G-CSF、IL-17A及MCP-1／CCL2的產生，調控流行性感冒中的肺部炎癥反應。α1-抗胰蛋白酶是機體重要的內源性NSPs抑制劑，可以以自殺性底物抑制的方式有效抑制NE及CG的活性。α1-抗胰蛋白酶是機體先天免疫反應中的抗炎蛋白，其缺失與肺氣腫及肝疾病密切相關。Ekeowa等［18］的研究發現α1-抗胰蛋白酶與慢性阻塞性肺病有關。SLPI的β發夾結構的N端可與胰蛋白酶結合，而C端可與中性粒細胞彈性蛋白酶結合，可自由穿過中性粒細胞與基質間的空隙而在較大范圍內調控蛋白酶的活性。除主要抑制NE和胰蛋白酶的活性以外，SLPI還可以作用于CG，并作為一種多效應蛋白參與先天免疫、抗炎反應和病原體感染等過程。Guerrieri等［19］研究了SLPI對淋巴細胞增殖和細胞因子產生的影響，他們發現SLPI處理的單核細胞條件培養基，可以抑制CD4＋淋巴細胞的增殖和I型助T細胞因子的分泌，并影響包括γ干擾素、IL-4、IL-6及IL-10在內的其它細胞因子的分泌，這提示SLPI可能也參與了后天免疫過程。elafin與SLPI具有40%的同源性，是NE、PR3以及胰腺彈性蛋白酶的特異性抑制劑，但對CG沒有明顯的抑制作用。Motta等［20］研究表明elafin可以通過調控一系列炎癥介質和增強腸壁屏障作用抑制大腸炎老鼠模型中的大腸發炎，可能成為腸炎疾病的一個治療靶點。Wang等［21］研究也表明血漿NE和elafin的平衡失調與急性呼吸窘迫綜合征的發生發展密切相關，在急性呼吸窘迫綜合征的早期elafin急速降低。

人內源性NSPs抑制劑不僅可以抑制機體自身絲氨酸蛋白酶的活性，而且可以調節細胞因子和趨化因子的釋放，調節機體的先天免疫功能以及發揮多層次的抗炎作用。但是被激活的中性粒細胞可以通過以下途徑阻止內源性蛋白酶抑制劑對NSPs的抑制。首先，中性粒細胞可產生大量自由基致使氧敏感的內源性NSPs抑制劑失活；其次，NSPs可與彈性蛋白結合到一起抵制內源性蛋白酶抑制劑的抑制作用。最后，NE和細胞溶酶體中其他蛋白酶能結合于陰離子表面可得到保護而不被破壞。另外也有研究表明，激活的中性粒細胞釋放的其他蛋白酶如MMP-9也可以降解NSP抑制劑如絲氨酸蛋白酶抑制劑α1-抗蛋白酶，從而延長NE蛋白裂解時間、增強蛋白裂解［22］。

3.2 外源性中性粒細胞絲氨酸蛋白酶抑制劑 由于內源性抑制劑抑制作用的局限性以及機體自身調節功能的有限性，開發外源性NSPs抑制劑以應用于臨床治療具有迫切的市場需求和重要的醫學研究價值。目前主要對NE抑制劑有較多研究［23］，對CG抑制劑近年也有少量研究［24］，而對PR3及NSP4的抑制劑研究極少。目前外源性NSPs抑制劑主要有化學合成抑制劑、天然性抑制劑以及一些其他天然模擬肽和非肽化合物。

3.2.1 化學合成抑制劑 化學合成類NSPs抑制劑根據化學結構可以分為多肽類和非多肽類結構。目前對NE抑制劑關注較多，大多數化學合成NE抑制劑存在毒性較大、化學穩定性較低、體內有效活性低和藥效延續性差等問題，因此直至目前只有ONO-5046（sivelestat sodium，西維來司鈉）是唯一成功進入臨床的化學合成中性粒細胞彈性蛋白酶特異性抑制劑［25］。正在進行臨床研究的NE抑制劑AZD9668亦表現出較好的結果［26］。目前發現的CG抑制主要為β-ketophosphonic acids、氨基膦酸酯、乳香脂酸（boswellic acids）等的衍生物及基于α1-PI、BPTI設計的模擬肽等［24］，但還沒有CG抑制劑進入臨床研究。

3.2.2 天然性抑制劑 天然性NSPs抑制劑主要是指一些中藥提取類物質，根據其化學結構不同可分為酚類化合物（如EGCG可以以非競爭性抑制方式明顯抑制NE的作用，且活性高出內源性抑制劑α1-抗胰蛋白酶30倍之多［27］）、萜類化合物（如PL3S能夠通過作用鈣離子、AKT和p38信號通路抑制中性粒細胞的脫顆粒，進而抑制超氧自由基的產生和 NE的釋放［28］）以及吲哚類生物堿［如 4-（4，6-dihydroxy-3-methoxy-3H-isoindol-1-yl）-benzoic acid在體外實驗中可以明顯抑制 NE的活性［29］］等。

3.2.3 重組多肽抑制劑 目前對NE的多肽特異抑制劑地來司他（depelestat）-一種由58個氨基酸殘基組成的重組多肽，已完成治療ARDS的臨床Ⅱ期研究。我們最近也分離到一種特異性好、活性強的NE多肽抑制劑-AduTIL1［30］，在后續的急性肺損傷及棉球肉芽腫動物實驗中表現出較好的抗炎作用效果。

4 結語與展望

NSPs與炎癥反應密切相關。炎癥反應時，激活的中性粒細胞可釋放出過量的NSPs，上調細胞黏附分子，促進中性粒細胞與內皮細胞黏附及組織浸潤、釋放促炎癥分子、激活補體以及誘導細胞因子表達，而這些物質又能吸引和激活中性粒細胞釋放更多的NSPs，這些多重效應構成了一個NSPs釋放的級聯放大反應而形成惡性循環，使炎癥反應明顯放大。因此，針對NSPs靶點的抑制劑可能用于防治炎癥性反應疾病，而尋求高效、可靠的NSPs抑制劑，有望開發出高效的炎癥性疾病防治新藥。然而，雖然目前有關NE抑制劑的研究得到較大關注，但對CG、PR3及NSP4抑制劑的研究重視程度尚遠遠不夠。此外，由于幾種NSP具有相似結構，如何篩選和設計對各NSP具有抑制特異性的抑制劑也是需要面對的重要問題。

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