樹鼩在肝臟疾病動物模型應用的研究進展

邢會杰，方梅霞，宋琳亮，和 君，李守軍，傅江南

(1.暨南大學實驗動物管理中心，廣州 510632;2.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

生物學研究中動物模型的使用仍將持續很長一段時間。由于倫理及其他如可控性、方便操作及成本效益等方面問題，許多基于人類疾病機理研究和藥物研發的實驗只能依賴于動物模型的建立和使用［1］。考慮到非人靈長類實際使用的限制，生物學研究中尋找非人靈長類的替代動物顯得尤為必要及緊迫。樹鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一種生活在熱帶和亞熱帶地區的哺乳綱攀鼩類的小型動物，盡管樹鼩精確的系統發育地位仍存在爭論，但是一致認為其與靈長類密切關聯［2］，與人類有較近的親緣關系。最近，昆明動物研究所通過對樹鼩全基因組測定和解析，發現樹鼩在神經及免疫系統等方面與人類相比具有高度同源性，在很多方面具有可用來替代獼猴等大型靈長類實驗動物的遺傳基礎，可能還適合于更多的免疫學、神經生物學及代謝等生物學問題和疾病機理的研究［3］。已有證據表明樹鼩非常適合用于人體的近視、心理應激和肝炎等問題的研究，且對多種人類易感病毒敏感［4］，本文對近年來利用樹鼩在肝臟疾病動物模型中的應用進展綜述如下。

1 乙型肝炎病毒模型

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)感染是全球和我國的重要健康問題，建立方便有效的HBV感染動物體內模型是開展HBV相關基礎和臨床研究的重要前提，缺乏合適的體內外感染HBV實驗模型是阻礙HBV基礎和臨床研究發展的主要瓶頸。因此，建立方便有效的、與人類有較近親緣關系的動物感染人HBV模型，是研究HBV的生物學特性、感染致病機理及有效防治措施所亟需的重要課題［5］。周勇等［6］將 HBV1.2 質粒通過大隱靜脈用水動力注射方法轉入樹鼩肝臟，檢測樹鼩血清中ALT、HBV DNA，HBsAg、HBsAb，結果發現轉染HBV1.2質粒后樹鼩血清中能檢測到相關陽性指標，表明大隱靜脈水動力注射法能夠作為樹鼩肝臟外源基因導入的一種方法，這為樹鼩成為慢性HBV感染模型打下了一定基礎。有人對56只新生樹鼩接種來自HBV感染病人或樹鼩的血清后分階段收集血清和肝臟樣品，利用 qPCR、酶聯免疫分析、Southern blot和免疫組化等檢測分析方法，在接種48周后有6只樹鼩被確定和4只疑似表現出慢性HBV感染，結果表明樹鼩幼仔與人類相比具有一定的可被HBV慢性感染的頻率，從而初步建立了樹鼩HBV慢性感染模型［7］。同時，作者對持續感染6年HBV的樹鼩通過DNA分析、肝臟超微結構電鏡檢測等方法發現肝細胞水腫，脂肪和嗜酸性變性，淋巴細胞浸潤和門管區小膽管增生，多區域肝壞死融合形成纖維化和硬化的連接和巨紅細胞癥，其感染HBV病毒的肝臟病理學變化與人相似［8］。以上研究表明，樹鼩具有作為 HBV感染新模型的應用前景。

2 丙型肝炎病毒模型

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)呈世界流行性，大約3%的世界人口遭受慢性HCV困擾，到目前為止，還沒有預防或治療HCV的疫苗面世，因缺乏合適的動物模型是導致對HCV免疫和病源機制研究和研制更有效治療藥物的主要阻礙因素之一。除了人類之外，黑猩猩是對HCV易感的唯一物種［9］。由于HCV缺乏理想的動物模型，近年來，國內外學者對樹鼩是否可成為HCV感染的動物模型作過一些十分有益的嘗試。Zhao等［10］闡明HCV可在樹鼩原代肝細胞進行有效的復制和病毒合成，他們利用HCV病人血清或血漿感染樹鼩原代肝細胞，通過反轉錄PCR檢測到負性單鏈RNA和病毒顆粒證實病毒在樹鼩原代肝細胞可進行有效的感染和復制。Amako等［11］等用HCV患者血清和HCV全長cDNA重組的病毒顆粒感染樹鼩建立HCV樹鼩模型，并經過長達3年觀察，通過各項指標檢測進行HCV感染樹鼩后的病原學研究，結果發現急性感染階段出現中度肝炎和斷斷續續的病毒血癥，并可導致脂肪變性，肝硬化，結節和腫瘤。且通過組織學分析發現HCV引起的慢性肝炎和進一步惡化之間存在時間依賴性。為進一步評價樹鼩HCV是否是由傳染的病毒質粒引起的，用被感染HCV的樹鼩血清去感染幼齡樹鼩，然后通過對HCV RNA進行檢測分析發現受者樹鼩也表現出中度肝炎和斷斷續續的病毒血癥，同時將具有較高豐度的HCV感染樹鼩的血清接種幼年樹鼩后呈現急性感染，表明樹鼩可有效感染和轉染HCV，但是樹鼩模型和人類感染HCV后的不同之處在于樹鼩較難保持HCV病人所表現的持續病毒血癥現象［12］。這些結果表明樹鼩有望成為HCV感染和疾病研究的有效動物模型進行HCV病因及發病機制等方面的深入研究。

3 其它病毒肝炎模型

可用于甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)研究的動物模型較少，1981年詹美云等人對HAV感染樹鼠句進行了初步的研究，他們用0.5%HAV陽性病人新鮮大便濾液0.5 mL感染9只成年樹鼠句。通過檢測抗原、抗體、轉氨酶及肝組織病理檢查等指標，在感染2～16周后，78%的樹血清中檢測出了HAV抗體，轉陽率75%。這些證據說明樹鼠句有可能成為人類甲肝病毒敏感的動物。有人認為丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)的復制必需依靠HBV的輔助，因此HDV感染模型必須以HBV感染為基礎［13］。有人以樹鼩為對象研究證實在感染HBV的基礎上，可通過同時和重疊感染的方式感染HDV。肝組織病理學觀察發現，樹鼩感染HDV后，引起的HDV的肝臟病理變化與人類的極其相似，可呈現不同的病理類型，易形成慢性發病過程，從而建立HDV/HBV實驗感染樹鼩動物模型［14］。Yan等［15］認為樹鼩通過轉染HBV/HDV病毒全基因組可以在樹鼩肝臟細胞檢測到病毒復制，并指出鈉離子/牛磺膽酸共轉運蛋白抗原(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)在病毒侵入和限制病毒感染方面具有重要作用。以上結果表明，樹鼩具有感染甲肝及丁肝的可能，但能否作為此類肝炎病毒的有效模型，尚需進一步深入開展研究。

4 非酒精性脂肪肝模型

郭小芳等［16］為探討羅格列酮對脂肪肝細胞PPA R表達的影響，通過對樹鼩飼喂高糖高脂飼料建立樹鼩非酒精性脂肪肝模型，通過實驗前后檢測體重(wt)、空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FIN S)、總膽固醇(T C)、甘油三醋(T G)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。實驗結束時剖腹取肝標本，光鏡下觀察肝臟形態學改變，以免疫組化法檢測肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體(PPA R)表達水平，結果發現，高糖高脂喂養樹鼩后與空白對照組相比，其FBG、FINS等均明顯升高，肝臟形態學發現嚴重肝脂肪變性。此結果說明高糖高脂飲食可介導樹鼩引起肝脂肪變性。牛昱宇等［17］使用每公斤樹鼩普通飼料加20 g膽固醇和200 g豬油為高脂飼料，供樹鼩自由采食的方法建立樹鼩非酒精單純性脂肪肝動物模型，結果發現7周后，60%的樹鼩呈明顯脂肪肝癥狀，14周后，80%的樹鼩呈明顯的脂肪肝癥狀，其中20%的樹鼩呈重癥脂肪肝癥狀，部分樹鼩有約95%的肝細胞脂肪化。以上結果表明樹鼩可用于非酒精性脂肪肝動物模型，尤其是單純性脂肪肝的藥物研究與功效評價。

5 肝癌模型

黃曲霉毒素是通過聚酮途徑由黃曲霉和寄生曲霉所產生的一種對人類和畜禽危害最大、最常見的霉菌毒素。黃曲霉毒素為肝臟毒素，主要損害肝臟，除了主要誘使動物發生肝癌外，也能誘發胃癌、腎癌、直腸癌及乳腺、卵巢、小腸等部位的癌癥［18］。Li等［19］利用黃曲霉素對對樹鼩進行處理約90周建立樹鼩肝癌模型用以研究黃曲霉毒素介導的肝細胞癌形成過程中的基因調控作用，通過對實驗處理組樹鼩肝臟標本進行分析發現樹鼩肝臟發生癌細胞變。Yan等［20］在建立了樹鼩實驗感染人HBV模型的基礎上，進行了黃曲霉毒素與人HBV雙因素在肝細胞癌形成中作用的研究，結果首次在動物體內證實黃曲霉毒素和HBV在肝細胞癌形成過程中有協同作用。Su等［21］利用HBV和黃曲霉素對樹鼩處理后，研究p53蛋白和p21蛋白在樹鼩肝癌形成過程中的表達，發現p53蛋白的變異和肝癌的發生密切相關，p21蛋白的過量表達在肝癌的發生發展過程中起到重要的作用。

綜上所述，樹鼩在人類肝臟疾病模型中的應用已經進行了廣泛的研究，但由于以往研究所用的樹鼩多為野外捕獲的動物，還沒有實現樹鼩標準化，因此，在建立樹鼩肝臟疾病模型的穩定性和重復性方面存在不足，致使一些學者提出質疑，很大程度上限制了樹鼩作為肝臟疾病動物模型應用的研究進展。但隨著樹鼩規模化繁殖、生物凈化及建立相應的微生物質量控制品系后，樹鼩將會在包括肝臟疾病在內的醫學生物學領域發揮極大的作用，尤其在人類疾病的致病機理研究和建立人類疾病的樹鼩模型對治療藥物的開發及其評價方面具有廣闊的應用前景。

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