非轉移細胞1蛋白（NM23A）的研究進展

魏秋華

（軍事醫學科學院解放軍疾病預防控制所，北京 100071）

NM23A蛋白又稱為NDPK-A、AWD或NM23-H1蛋白，屬于NM23這一結構與功能保守的蛋白大家族［1］。該家族蛋白是nm23基因的表達產物。1988年，Steeg等［2］應用差別克隆雜交首先發現并確認該基因為腫瘤轉移抑制基因，因此，命名為非轉移性（non-metastatic）。該基因在多種生物如哺乳動物、細菌、酵母、植物、果蠅中均存在，至今在人體內發現8個nm23基因家族，其中研究最為廣泛的是nm23-H1與nm23-H2基因，均位于17號染色體長臂著絲點附近［3］。

NM23蛋白家族由4-6個折疊亞單位組成，均具有二磷酸核苷激酶（NDPK）活性［4］。NM23A（NDPK-A）是人體中nm23-H1基因的產物，為NDPK的亞基之一，由152個氨基酸組成，蛋白質量為17.149 ku，在細胞內主要定位于細胞核與細胞質，但在細胞表面、線粒體、內質網以及胞外液均發現了該類蛋白［1］。除了二磷酸核苷激酶活性外，NM23A蛋白在體內還可以調節一系列包括生長與發育的細胞過程，在腫瘤發病、轉移過程以及中樞神經系統發育及疾病發生過程也具有一定意義。目前，許多研究主要集中在包括信號轉導、基因調節等其它可能的蛋白功能方面。現將其相關研究進展綜述如下。

1 NM23A蛋白的生理功能

1.1 二磷酸核苷激酶活性［5－7］NM23存在于幾乎所有的生物與細胞中，其主要的異構體NM23A與NM23B分別由nm23-H1與nm23-H2編碼，可以非特異性地催化二磷酸核苷激酶轉化為三磷酸核苷激酶。兩個蛋白均為同源六聚體，具有88%序列一致性。高分辨率的X-射線結構顯示，NM23六聚體從頂端看是3個二聚體的聚合，從底端看為兩個三聚體的聚合。與底物相互作用的組氨酸H118及其它殘基定位于接近頂端與底端表面的裂隙。NDPK-A與NDPK-B以相同的方式與核苷酸底物結合。盡管二者等電點明顯不同，但具有相似的動力學參數，二者作為磷酸轉移酶可以互換。

NDPKA可催化三磷酸核苷酸的γ磷酸基團轉移至二磷酸核苷酸。在蛋白以乒乓機制介導的磷酸化過程中，只有1個核苷酸結合位點與催化位點。乒乓機制包括NDPK-A中1個保守的組氨酸作為中介，其咪唑側鏈可被自我催化磷酸化。該酶可以接受具有所有天然堿基與2′脫氧核糖及核糖的核苷酸底物。因此，它可以產生RNA、DNA合成的所有底物。NDPK-A核苷酸配體的解離常數測定顯示，鳥苷酸結合力強于腺苷酸，而胞苷酸結合力最低，可能的理由是鳥苷酸通過N2氨基基團具有了其它相互作用。眾多不同核苷酸配體的結合結構顯示，NDPK-A與所有的底物在同一位點以同一構象結合。

作為高效率的磷酸轉移酶，NM23A可以在細胞內生成多種代謝功能所需的核苷酸，如 DNA、RNA合成所需的NTPs，多聚糖合成所需的UTP，脂類合成所需的CTP，微管聚合、蛋白延伸以及信號轉導所需的GTP等，說明NM23A參與了細胞中多種生物活性，對細胞的存活具有重要作用。

1.2 對細胞生長、代謝調節作用 除了磷酸激酶活性，NM23A還在細胞的增生、分化、代謝過程中具有一定作用［8－11］。已發現NM23A是血小板源性生長因子基因的潛在負性調節劑，可以識別PDGF啟動子與基因沉默活性相關的負調控元件。一些報道提出，NM23A的表達和（或）活性可以調節神經細胞的增生、分化以及神經軸突的生長。此外，NM23A對細胞分化也具有一定抑制作用。Roel在正常人類造血干細胞的體外分化定量分析中加入重組NM23A蛋白，觀察其對造血系統的細胞內效應，結果證明NM23A蛋白對正常造血細胞分化的末期具有調節效應。血漿中存在相對較高濃度的NM23A，對紅細胞的形成具有支持作用，并抑制過多的巨噬細胞的形成。也曾有報道NM23A在造血祖細胞中高度表達，并對其分化具有下調作用。此外，在增殖淋巴細胞中也觀察到了NM23A的高表達水平。Steeg等證實，NM23-A作為黑素瘤的過表達基因，具有引起細胞低代謝的能力。因此，可以提出假設，NM23A作為高代謝細胞系中確認的代謝抑制基因，可以引起細胞代謝能力的降低。由于使用激酶活性滅活的突變NM23A后，與天然NM23A相比，調節效應沒有任何改變，提示NM23A通過獨立于磷酸轉移酶活性的機制，如通過與受體或可溶性分子（如生長因子）的蛋白相互作用介導其細胞內效應，引起了特定信號轉導途徑的激活或抑制效應。

1.3 信號傳導作用 NM23A至少有4種生化活性與調節信號傳導有關，包括蛋白－蛋白的相互作用、GTP-結合蛋白功能的調節、DNA-結合相關的活性，以及組氨酸－依賴的蛋白磷酸轉移酶活性。

由于具有GTP合成功能，NM23A可能通過GTP供應或調節G蛋白激活過程中的酶的作用，參與受體依賴或非受體依賴的G蛋白信號傳導過程。NM23A誘導自由GDP，還是結合于G蛋白α亞基的GDP具有一些爭論，但是對闡述NM23A在G蛋白激活中的功能并不重要。實際上，已經有大量證據顯示 NM23A參與了 G蛋白的激活［12－15］。例如，NM23A可以在激動劑與HL-60白血病細胞膜上趨化因子受體的結合、受體介導磷脂酶C活化以及花生四烯酸刺激NADPH氧化酶活性等過程中發揮調節作用。Susanne等證明了在ATP與GDP底物存在的情況下，心肌的膜結合NM23A等二磷酸核苷激酶可以通過活化G蛋白非受體依賴型的抑制心肌AC活性。Angela等發現NM23A可以調節激動劑介導的毒蕈堿門控K＋通道的脫敏過程，作用機制與GTP的生成無關。作者推斷，NM23A可能作為毒蕈堿門控K＋通道脫敏過程的抑制劑，而絲氨酸120對該作用是必需的。

除了異聚體G蛋白，NM23A還可與Ras家族中的成員、ADP核糖基化因子、微管蛋白以及小GTP結合蛋白相互作用［16］。此外，在體內NM23A還可以通過DNA結合相關活性調節信號轉導［6］。

2 NM23A在病理過程中的作用

2.1 腫瘤轉移抑制效應［12，17－18］盡管 NM23作為一種磷酸激酶已經在幾十年前被人們所知，但編碼A亞基的基因nm23-H1，直到1988年才被Steeg等［2］確認。基于該基因在具有高轉移或低轉移能力的黑色素瘤細胞系中表達減少，因此，確定其為潛在的轉移抑制基因。多種惡性腫瘤細胞的轉移與NM23A蛋白的含量呈負相關。在高轉移性腫瘤細胞系如K-1735黑色素瘤細胞、原發乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌等中，nm23A mRNA的含量均明顯減少。

已證實NM23A抑制腫瘤轉移的機制與NDPK活性無關，但明確的機制還沒有確定。研究發現，NM23A在抑制腫瘤細胞轉移的過程中可能的作用有：①減少GDP生成GTP的量，抑制腫瘤細胞微管聚合，并抑制腫瘤細胞轉移。②由于GTP不足，腫瘤細胞生長因子與細胞膜結合后信號傳導發生障礙，以致腫瘤細胞的生長轉移。③可直接與腫瘤細胞膜上的G蛋白結合，阻斷細胞生長信號傳導。

2.2 在中樞神經系統疾病中的作用 NM23A的二磷酸核苷激酶活性在腦部高于其它組織，并且胚胎發育早期表達主要集中在神經系統。該蛋白可以調節神經細胞的增生、分化以及神經軸突的生長，提示其在腦功能中可能扮演著重要的角色。

有研究顯示，NM23A可能參與了具有腦部損傷的神經退行性疾病［19］。Seong等首先報道，NM23A可能參與了具有腦部疾病的神經退行性疾病阿爾采末癥（Alzheimer disease，AD）及唐氏綜合癥（Down’s syndrome，DS）。采用蛋白組技術測定患有AD、DS的病人7個腦區NM23A的蛋白水平，發現兩種疾病中NM23A在各腦區（額葉、枕葉、頂葉皮質）均有明顯減少。曾有報道，NM23的氧化修飾可以滅活NM23的催化活性，提示氧化修飾可以是NM23蛋白功能調節的一種方式，這也可能是在AD與DS中，對氧化刺激較為敏感的特定腦區NM23活性明顯減少的原因［20］。

細胞骨架的破壞，如缺陷型的微管聚集是AD的重要病理特征，細胞骨架蛋白的再表達也被認為是一種異常分支反應，并與AD的神經病理改變相關。有報道NM23A具有通過影響細胞骨架蛋白表達驅使軸突生長的能力，NM23A蛋白異常會帶來神經過程如軸突生長與軸突分支的缺陷［21］。此外，還有研究顯示，神經退行性疾病中異常的NM23與其它因子如大腦癌蛋白18、神經內分泌特定蛋白C缺陷共同引起了腦細胞的異常增生與分化［22］。

總之，NM23A表達／活性的減少可以通過改變細胞骨架蛋白結構，影響軸索生長、軸突分支等神經過程，反之帶來腦細胞的異常增生與分化。此外，NM23A的減少還可以帶來突觸的功能異常，表現出了AD-樣神經退化疾病的主要病理特征。因此，作為多功能蛋白NM23A的活性減少可以通過多種途徑影響中樞神經系統發育及疾病發生，有可能成為疾病干預治療的新的候選分子。

2.3 與阿片受體信號傳導的關系 NM23A在阿片依賴病理過程中有何作用，國內外尚未見報道。通過對NM23A生物學功能的調研分析和前期研究，我們認為NM23A可能參與了阿片依賴過程，依據有以下3個方面：①阿片受體屬G蛋白偶聯受體，而NM23A是一種調節G蛋白活性的重要因子，參與其信號轉導過程，因此，至少在理論上講NM23A有可能調節阿片受體作用系統的功能。激動劑長期作用下，阿片受體在受體水平和受體后信號轉導水平發生的代償性適應是阿片依賴發生的分子基礎，我們推測，NM23A有可能通過調節阿片受體信號轉導過程而影響阿片依賴。Zhang等首次報道了NM23A對阿片受體的調節以及受體與G蛋白偶聯過程的作用。在研究中，通過穩定轉染克隆的大鼠μ-阿片受體的中國倉鼠卵巢細胞膜觀察了NM23A是否對激動劑與μ阿片受體的結合具有調節作用。結果證明，NM23A在該細胞膜中具有NDPK活性，且通過將ATP、GDP轉換為GTP，NM23A可以調節激動劑對μ-阿片受體的結合以及阿片受體的信號轉導。NM23A調節G蛋白偶聯受體信號轉導的研究目前僅限于激動劑急性作用下受體瞬時激活狀態的影響［23］。而NM23A對激動劑長期作用下G蛋白偶聯受體信號轉導的代償性適應有何影響，尚未見報道。②研究發現阿片成癮機制與學習記憶有許多相關之處，依賴及復吸可被看作一種病理性的學習記憶過程。阿片類藥物通過參與突觸可塑性形成，并改變神經回路功能導致藥物成癮［24］。已知NM23A可參與神經細胞的增生、分化以及神經軸突的生長，在學習記憶中起重要作用。因此，我們推測NM23A也可能通過調節學習記憶過程而影響阿片依賴。目前，有研究發現阿爾采末癥患者在額葉、顳部、枕葉等多個腦區NM23A表達水平明顯降低［25］，而阿片依賴時腦內NM23A含量有何變化尚未見報道。

總之，根據有限的實驗結果可以推測，NM23A參與了阿片受體信號轉導過程。關于NM23A在與異聚體G蛋白偶聯的阿片受體以及其他受體的信號傳導過程中扮演什么角色，還有許多爭論。NM23A是一個具有酶活性，可以與PTX敏感型G蛋白相互作用的受體，還是一個新型的G蛋白調節效應器系統，可以調節G蛋白的活性？或者是一個可以與受體偶聯介導效應器系統（如作為G蛋白的替代物）？NM23A在G蛋白的活化中具有一定作用，但G蛋白在NM23A的激活中有何作用？這一系列的問題都有待確定。

3 結語

NM23A蛋白是一類在多個物種廣泛分布、功能多樣的蛋白質。除了二磷酸核苷激酶活性外，NDPK-A蛋白在體內還可以調節一系列包括生長與發育的細胞過程，在腫瘤的發病機制與轉移過程中也具有一定意義。目前，許多研究主要集中在包括信號轉導、基因調節等其它可能的蛋白功能方面，其與中樞神經系統疾病、阿片耐受與依賴病理過程的關系仍需進一步研究。對于NM23A的生理、病理功能進一步闡明，有助于確認該蛋白作為特定疾病治療干預的重要靶點。

參考文獻：

［1］ Bosnar M H，Bago R，Cetkovic H.Subcellular localization of Nm23／NDPKA and B isoforms：a reflection of their biological function［J］.Mol Cell Biochem，2009，329（1－2）：63－71.

［2］ Steeg P S，Bevilaqua G，Kopper L，Thorgeirsson U P.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst，1988，80（3）：200－4.

［3］ Saha A，Robertson E S.Functional modulation of the metastatic suppressor Nm23-H1 by oncogenic viruses［J］.FEBS Lett，2011，585（20）：3174－84.

［4］ Huang J Y，Chang T，Chang CY，Chen CJ.Crystal structure of nucleoside diphosphate kinase required for coleoptile elongation in rice（Oryza sativa L.）［J］.J Struct Biol，2005，150（3）：309－18.

［5］ Chen Y，Gallois-Montbrun S，Schneider B，Véron M.Nucleotide binding to nucleoside diphosphate kinases：X-ray structure of human NDPK-A in complex with ADPand comparison to protein kinases［J］.J Mol Biol，2003，332（4）：915－26.

［6］ Zhou Q，Yang X，Zhu D，et al.Double mutant P96S／S120G of Nm23-H1 abrogates its NDPK activity and motility-suppressive ability［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，356（2）：348－53.

［7］ Song Y N，Lu C Y，Chen J，Qiu G F.Characterization of a novel nm23 gene and its potential roles in gametogenesis in the prawn Macrobrachium rosenbergii（de Man，1879）（Crustacea：Decapoda）［J］.Gene，2013，531（1）：1－7.

［8］ Jin L，Liu G，Zhang CH，et al.Nm23-H1 regulates the proliferation and differentiation of the human chronic myeloid leukemia K562 cell line：a functional proteomics study［J］.Life Sci，2009，84（13－14）：458－67.

［9］ Chou C C，Yung B Y，Hsu C Y.Involvement of nPKC-MAPK pathway in the decrease of nucleophosmin／B23 during megakaryocytic differentiation of human myelogenous leukemia k562 cells［J］.Life Sci，2007，80（22）：2051－9.

［10］Willems R，Slegers H，Rodrigus I，et al.Extracellular nucleoside diphosphate kinase NM23／NDPK modulates normal hematopoietic differentiation［J］.Exp Hematol，2002，30（7）：640－8.

［11］Wright K T，Seabright R，Logan A，et al.Extracelluar Nm23H1 stimulates neurite outgrowth from dorsal root ganglia neurons in vitro independently of nerve growth factor supplementation or its nucleoside diphophate kinase activity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，398（1）：79－85.

［12］Tee Y T，Chen GD，Chen L Y，et al.Nm23-H1：a metastasis-associated gene［J］.Taiwanese J Obstet Gynecol，2006，45（2）：107－13.

［13］Mitchell K A，Szabo G，de SOtero A.Direct binding of cytosolic NDP kinase to membrane lipids is regulated by nucleotides［J］.Biochem Biophys Acta，2009，1793（3）：469－76.

［14］Lutz S，Hippe H J，Niroomand F，Wieland T.Nucleoside diphosphate kinase-mediated activation of heterotromeric G proteins［J］.Methods Enzymol，2004，390：403－18.

［15］Ostero A S，Doyle M B，Hartsough M T，Steeg P S.Wide-type NM23-H1，but not its S120 mutants，suppresses desensitization of muscarinic potassium current［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1449（2）：157－68.

［16］Chopra P，Koduri H，Singh R，et al.Nucleoside diphosphate kinase of Mycobacterium tuberculosis acts as GTPase-activating protein for Rho-GTPases［J］.FEBSLett，2004，571（1－3）：212－6.

［17］Steeg P S.nm23 metastasis suppressor gene［M］／／Bertino J R.Encyclopedia of cancer.2nd ed.San Diego：Academic Press，2002：323－7.

［18］Marshall JC，Collins J，Marino N，et al.The Nm23-H1 metastasis suppressor as a translational target［J］.Eur J Cancer，2010，46（7）：1278－82.

［19］Kim SH，Fountoulakis M，Cairns NJ，et al.Human brain nucleoside diphosphate kinase activity is decreased in Alzheimer’s disease and Down syndrome［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，296（4）：970－5.

［20］Song E J，Kim Y S，Chung E K，et al.Oxidative modification of nucleoside diphosphate kinase and its identification by matrix-assisted laser desorption／ionization time-of flight mass spectrometry［J］.Biochemistry，2000，39（33）：20090－7.

［21］Owlanj H，Jie Yang H，Wei Feng Z.Nucleoside diphosphate kinase Nm23-M1 involves in oligodendroglial versus neuronal cell fate decision in vitro［J］.Differentiation，2012，84（4）：281－93.

［22］Cheon M S，Fountoulakis M，Cairns N J，et al.Decreased protein levels of stathminin adult brains with Down syndrome and Alzheimer′s disease［J］.J Neural Transm Suppl，2001，61：281－8.

［23］Zhang D，Li J G，Chen C，et al.Nucleoside diphosphate kinase associated with membranes modulatesμ-opioid receptor-mediated［35S］GTPγS binding and agonist binding toμ-opioid receptor［J］.Eur J Pharmacol，1999，377（2－3）：223－31.

［24］Berke J，Hyman S E.Addiction，dopamine，and the molecular mechanisms of memory［J］.Neuron，2000，25（3）：515－32.

［25］Pu L，Bao G B，Xu N J，et al.Hippcampal long-term poteniation is reduced by chronic opiate treatment and can be restored by reexposure to opiates［J］.Neurosci，2002，22（5）：1914－21.