bFGF抑制自噬相關蛋白LC3保護大鼠急性脊髓損傷

張 謝，宋毓飛，周 華，祁 峰，王丹萍，章雅丹，張宏宇，肖 健

（寧波市醫療中心李惠利醫院1.消化內科、2.藥劑科、3.骨科，浙江寧波 315040；4.寧波大學醫學院，浙江寧波 315211；5.溫州醫科大學藥學系，浙江 溫州 325035）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的治療一直是神經損傷修復領域的醫學難題，其致殘率與致死率非常高。自噬（autophagy）是一種細胞通過溶酶體降解途徑調控的細胞器和蛋白循環過程，其與衰老、免疫、細胞死亡和分化有關［1］。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促進血管生成、神經保護、軸突再生、組織修復等作用。故本文研究bFGF與細胞自噬相關蛋白LC3在脊髓損傷修復過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 重組 bFGF（Grost）；LC3Ⅱ、LC3Ⅰ（Danvers）；anti-mouse IgG HRP（Santa Cruz）。

1.2 SCI動物模型制備及給藥 SD大鼠隨機分為假手術組（sham）、模型組（SCI）與bFGF給藥組。10%水合氯醛麻醉，血管夾夾住T9脊髓2 min。bFGF給藥組，SCI后立即皮下注射80μg·kg－1重組bFGF，之后每天給予同劑量至處死。SCI組注射同劑量0.9%NaCl。

1.3 BBB評分 用 BBB評分法［2］于術后 1、3、7 d獨立觀察大鼠雙后肢行動功能，并記錄分數（后肢全部癱瘓為0分，完全正常行走為21分）。

1.4 Western blot檢測 取脊髓損傷段0.1 g，加入1ml裂解液，取上清提取蛋白。LC3Ⅱ、LC3Ⅰ（1∶1 000）4℃孵育過夜，anti-mouse IgG HRP（1∶2 000）室溫孵育 2 h，曝光，觀察。

1.5 免疫熒光染色法 用10%驢血清室溫孵育1 h，LC3（1∶500）4℃孵育過夜，anti-mouse IgG HRP（1∶500）室溫孵育1 h，洗滌，觀察。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學處理，數據以xˉ±s表示。采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 BBB評分 BBB評分結果顯示，術后1 d，SCI組和bFGF組BBB評分差異無顯著性；術后3 d，bFGF組BBB評分（6.3±0.6）高于 SCI組（2.7±0.7），P＜0.05；術后7 d，bFGF組大鼠可持續性前后肢協調行走（8.7±0.5），而SCI組大鼠后肢仍舊不能負重走動（5.7±0.7），P＜0.05。

2.2 bFGF通過抑制自噬相關蛋白LC3保護大鼠脊髓損傷

免疫熒光染色術后7 d結果顯示，與sham組相比，LC3蛋白在SCI組織中明顯增多，給予bFGF后下降。Western blot結果顯示，術后7 d，SCI組LC3Ⅱ表達及 LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值明顯上升；但是此效果給予bFGF后明顯抑制。

3 討論

目前研究認為SCI產生兩種機制，即原發性損傷機制和繼發性損傷機制。繼發性損傷是指在原發性損傷后發生的一系列病理生理改變，包括組織缺血、缺氧、炎癥反應和組織水腫，最終導致細胞凋亡［3］。

自噬作為一種早期的自我適應性機制，能清除受損的細胞器和蛋白，為組織穩態的恢復提供營養物質和能量。近期的研究表明，在受壓迫性損傷的脊髓組織中，自噬標志蛋白LC3明顯增加；應用缺氧條件模擬脊髓損傷，也能夠檢測到脊髓神經元中LC3表達升高［4］。本文應用重組bFGF于大鼠急性SCI模型中，同樣也發現脊髓損傷后LC3表達增加，給予bFGF后，表達下降。研究表明，bFGF能夠通過抑制自噬相關蛋白LC3促進SCI大鼠后肢功能恢復，這對于開拓新的生長因子類藥物在脊髓損傷中的應用有著重要的意義，相關研究國內還未見報道。

參考文獻：

［1］ Meschini S，Condello M，Lista P，et al.Autophagy：molecular mechanisms and their implications for anticancer therapies［J］.Curr Cancer Drug Targets，2011，11（3）：357－79.

［2］ Basso D M，Beattie M S，Bresnahan J C.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma，1995，12（1）：1－21.

［3］ Moon Y J，Lee JY，Oh M S，et al.Inhibition of inflammation and oxidative stress by Angelica dahuricae radix extract decreases apoptotic cell death and improves functional recovery after spinal cord injury［J］.J Neurosci Res，2012，90（1）：243－56.

［4］ Tanabe F，Yone K，Kawabata N，et al.Accumulation of p62 in degenerated spinal cord under chronic mechanical compression：functional analysis of p62 and autophagy in hypoxic neuronal cells［J］.Autophagy，2011，7（12）：1462－71.