Rho激酶與疼痛及其抑制劑的臨床應用

張雪瓊，張永鶴

Rho是一種小分子G蛋白，RhoGTP蛋白存在GDP、GTP兩種結合形式，在失活與激活狀態之間轉化而扮演著“分子開關”的角色。Rho激酶（Rho-associated coiled-coil-forming kinases，ROCK）是Rho的主要效應底物，含有兩種異構體ROCK1及 ROCK2，屬于絲／蘇氨酸蛋白激酶［1］。研究表明［2－3］，Rho／ROCK對細胞的收縮、遷移、增殖、黏附和凋亡等活動具有重要的調控作用。Rho／ROCK通過與血管緊張素Ⅱ、內皮素-1等血管活性物質相互作用，使肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活，從而導致血管痙攣。

針對Rho／ROCK信號通路抑制劑的藥物研發策略，主要集中在防治高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死和心力衰竭等心腦血管疾病。本文將通過闡述Rho／ROCK信號通路在疼痛的產生和持續過程中的作用及其抑制劑在臨床研究中的使用案例，探討Rho／ROCK作為鎮痛藥物作用靶點的可能性。

1 Rho／ROCK與疼痛

大量研究表明［4］，Rho／ROCK可促進炎性因子分泌，參與炎性因子損害，促進細胞凋亡，使神經突觸崩解等過程，在神經性疼痛、炎癥性疼痛、糖尿病性周圍神經疼痛、腦血管痙攣、血管痙攣性心絞痛及骨癌痛等多種疼痛的產生和持續過程中起重要作用。

1.1 Rho激酶與神經性疼痛、炎癥性疼痛 神經病理性疼痛綜合癥由神經系統損傷或相關疾病引起。在中樞神經系統各種功能出現障礙時，Rho／ROCK信號通路被異常激活。損傷成年脊椎動物的大腦和脊椎可激活ROCKs，從而抑制神經突觸的發育；抑制ROCKs可促進哺乳動物脊椎損傷后的神經再生和功能恢復；阻斷Rho／ROCK信號通路在腦卒中、炎癥、脫髓鞘病、阿爾采末病和神經性疼痛等多種動物模型上顯示有益的治療作用［4］。

周圍神經系統（包括神經元、神經、背根神經節、后根）和中樞神經系統（丘腦、脊髓）損傷均可引起神經性疼痛，其特點是機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏，目前尚無有效的治療方法。研究表明，炎性介質溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）在神經性疼痛的啟動過程中起關鍵作用。動物實驗表明，LPA通過激活RhoA／ROCK通路，啟動外周神經損傷引起的神經性疼痛。抑制Rho／ROCK通路，可阻斷LPA誘發的神經疼痛癥狀［5］。脊神經根切斷術1周后，鞘內注射ROCK抑制劑Y-27632不僅能夠降低冷痛覺過敏，還能誘發單胺能神經可塑性，提示，阻斷Rho／ROCK通路能夠增強神經突觸可塑性，并能減輕脊神經根切斷術后的疼痛［6］。

三叉神經痛是一種嚴重的慢性疼痛綜合征。其主要癥狀是強烈的刺狀痛或電休克樣陣痛。研究發現，采用1 nmol·L－1LPA注射至大鼠三叉神經節內誘導的三叉神經根脫髓鞘改變模型，預先給予 LPA1／3受體拮抗劑 DGPP和ROCK抑制劑Y-27632時，DGPP能拮抗機械性痛覺超敏和對損傷側痛覺的過度敏感反應，而Y-27632能對抗同側和對側的機械性痛覺的過度敏感反應。這些研究結果提示，拮抗LPA受體和抑制ROCK通路可能是一種脫髓鞘改變誘導的三叉神經痛樣傷害感受的重要治療方法［7］。

豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C的底物（myristoylated alamine-rich C-kinase substrate，MARCKS）作為腦內蛋白激酶C的重要底物，參與突觸運輸和神經遞質釋放，與炎性疼痛的形成和神經痛的維持密切相關。ROCK能使MARCKS的Ser159磷酸化，從而產生和維持神經病理性疼痛。動物實驗結果顯示，椎管內直接給予ROCK抑制劑可緩解福爾馬林誘導的炎性疼痛及選擇性L5脊神經切斷引起的神經性疼痛［8］。

在右側膝關節上注射Monoiodoacetate制備的大鼠關節炎模型中，發現ROCK1和ROCK2 mRNA水平明顯升高，連續3周注射ROCK選擇性抑制劑AS1892802至對側膝關節或口服給藥，能明顯減輕關節炎表面的磨損傷害。在體外實驗中，該抑制劑能夠誘導軟骨細胞分化，并抑制滑膜細胞中IL-1β或緩激肽誘導的前列腺素E2的產生，表明ROCK1和ROCK2在關節炎疼痛中起重要作用［9］。在Monoiodoacetate誘導的大鼠關節炎模型和鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘發的神經痛模型中，單次給與AS1892802，即可顯示短暫的止痛效應，重復給藥，則可發揮較強的持續的鎮痛效應，在末次給藥后，其鎮痛效應還能維持數日，證明外周ROCK在慢性疼痛的持續過程中，發揮重要作用［10］。

最近轉基因動物實驗研究結果也證明，RhoA GTPase-激活蛋白 DLC2（deleted in liver cancer 2）通過抑制 RhoA和ERK活性防止疼痛反應的擴散，在調控炎癥性疼痛中起關鍵作用，DLC2（－／－）轉基因小鼠為今后研究調控炎癥性疼痛提供有價值的動物病理模型［11］。

1.2 Rho激酶與糖尿病性神經痛 糖尿病性神經病變是糖尿病最常見的并發癥之一，引發患者日常生活中的諸多問題，嚴重影響患者的生活質量。對RhoA／ROCK信號通路在糖尿病的熱性痛覺過敏的影響研究結果顯示，在STZ誘導的糖尿病小鼠脊椎中的膜結合RhoA水平明顯升高，采用RhoA抑制劑胞外酶C3（exoenzyme C3）和肉毒梭狀芽胞桿菌（Clostridium botulinum）及Y-27632處理時，明顯降低熱痛覺過敏和機械性痛覺過敏。5-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）抑制劑辛伐他汀也能改善糖尿病小鼠的上述癥狀，提示ROCK抑制劑和HMG-CoA還原酶抑制劑可能是減輕糖尿病神經病變疼痛癥狀的有效化合物［12］。RhoA／ROCK信號通路可能參與了調控糖尿病神經痛的脊椎痛覺傳遞。這些發現為糖尿病神經痛提示了新的治療策略。

1.3 Rho激酶與血管痙攣性心絞痛、腦血管痙攣 冠心病心絞痛的發生，主要是因為冠狀動脈狹窄和（或）痙攣造成的心肌缺血、缺氧引起。長期給予Rho激酶抑制劑法舒地爾（8周），能夠逆轉實驗豬的粥樣硬化冠脈痙攣、損傷、壓力重構等血管性疾病的發展，對抗心肌缺血［13］。口服法舒地爾4周能通過減輕血管炎性反應、減少膠原沉積、對抗巨噬細胞遷移，防止豬冠狀動脈支架植入術后再狹窄和損傷［14］。在犬冠脈左前降支結扎致心肌缺血模型上，鹽酸法舒地爾和羥基法舒地爾均可改善心電圖ST段降低，增加局部心內膜血流［15］。

Yamaguchi等［16］的研究表明，在C6神經膠質瘤細胞中，ROCK調控TNF-α誘導的IL-6的產生，提示ROCK抑制劑有可能成為治療腦血管痙攣及其他中樞神經損傷的候選藥物。

1.4 Rho激酶與癌痛 嗜神經侵襲（perineural invasion，PNI）是指腫瘤細胞侵襲和轉移到神經系統。發生PNI是腫瘤惡化的標志，也是胰腺癌、結腸癌、膽癌、胃癌和直腸癌等多種惡性腫瘤所特有的病理改變。神經和入侵腫瘤細胞之間存在信號傳導，惡性腫瘤PNI嚴重限制腫瘤的局部控制，導致腫瘤的疼痛、復發和轉移。神經營養因子、黏附因子以及金屬蛋白酶等在PNI中起重要作用。最近研究表明，叢狀蛋白（plexin-B1）和腦信號蛋白（semaphorin）4D通過RhoA／ROCK信號通路促進PNI，提示了RhoA／ROCK信號通路在腫瘤的疼痛、復發和轉移中的重要作用［17］。

骨癌痛（bone cancer pain，BCP）嚴重影響癌癥骨轉移患者的生活質量，且部分患者的鎮痛治療方法通常也不規范［18］。研究表明［19］，轉化生長因子和 ROCK依賴機制參與轉移性腫瘤細胞到剛性礦化骨基質的侵襲過程。最近研究人員采用脛骨內注射Walker256細胞的方法，建立大鼠BCP模型，到d 9時鞘內注射10 pg RhoA抑制劑C3外酶，發現其不僅能夠緩解模型組大鼠的癌性骨痛行為，而且明顯降低模型組大鼠升高的脊椎RhoA和ROCK2蛋白水平。而預先鞘內注射1.5 pg RhoA激動劑U-46619時，上述作用完全被抵消，說明脊椎RhoA／ROCK信號通路可能參與了BCP的發生過程。這些結果提示，干預RhoA／ROCK信號通路有可能成為預防和治療BCP的新策略［20］。

1.5 其他 采用神經性和炎癥性疼痛以及辣椒素誘導的急性疼痛及機械性痛覺異常超敏等多種不同的疼痛模型進行的研究結果表明，RhoA／ROCK抑制劑法舒地爾（30 mg·kg－1）能夠降低大鼠脊神經結扎（spinal-nerve ligation，SNL，77%）、坐骨神經慢性壓迫損傷（chronic constriction injury，CCI，53%）、辣椒素誘導的二次機械性痛覺超敏（63%）、碘乙酸鈉誘導的關節炎疼痛（88%）、辣椒素引起的急性退縮行為（56%）等機械性痛覺過敏反應，但不能緩解角叉菜膠注射引起的炎性熱痛覺過敏和完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）注射引起的機械性痛覺超敏反應［21］。Y-27632在小鼠熱板法和扭體法鎮痛實驗中的結果也證明，ROCK參與了感受傷害性疼痛的發生過程，ROCK抑制劑可作為新型的鎮痛藥物［22］。

2 ROCK抑制劑法舒地爾鎮痛作用的臨床應用

ROCK抑制劑可能作用于多個靶點，通過舒張血管、改善循環、保護神經、抑制白細胞浸潤和吞噬而減輕炎癥損傷，促進神經再生和神經生長，阻斷神經痛的形成和維持，對缺血性卒中、腦和脊髓外傷、炎癥和脫髓鞘疾病、神經性疼痛、血管痙攣性疼痛及骨癌痛等起治療作用。

2.1 腦血管痙攣的治療 目前已上市的ROCK抑制劑只有鹽酸法舒地爾，用于治療蛛網膜下腔出血后的腦血管痙攣。而另一個ROCK抑制劑Y-27632僅被作為工具藥用于醫藥相關基礎研究。

急性缺血性腦血管病是一種發病率與致死率、致殘率很高的疾病，目前其發病率還在逐年增加。缺血引發的神經細胞損傷在臨床上最為常見。近期的臨床治療結果表明，急性腦梗死發病后72 h內，用鹽酸法舒地爾注射液治療，可改善神經系統癥狀和體征，減少致殘率。有研究表明，治療組46例中除有3例患者出現輕微心悸不適，1例出現血壓輕度下降外，未發現其他明顯不良反應，且可以明顯改善患者的神經功能狀況和臨床恢復情況，說明鹽酸法舒地爾是一種可用于治療急性缺血性中風的安全、有效的藥物［23］。

法舒地爾通過改善大腦皮質血流、增加缺血腦區局部血流量、抑制腦神經細胞和遲發性神經損傷，從而發揮對腦血管痙攣的緩解及治療作用。臨床研究顯示，應用法舒地爾可預防和治療蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣、支架置入術中的冠狀動脈和腦血管痙攣，且對頑固性腦血管痙攣也可能有效。

2.2 血管痙攣性心絞痛的治療 由于認識到Rho／ROCK在心肌缺血中的重要作用，法舒地爾作為抗心絞痛藥物進入了臨床試驗階段。口服鹽酸法舒地爾治療穩定型心絞痛的多中心Ⅱ期臨床試驗結果表明，在Ⅱa臨床試驗中經過抗心絞痛藥物清除期2周后，45例治療患者（5、10、20 mg，每日3次，連續服用2周）能夠明顯延長運動時間和心電圖ST段呈缺血性壓低1 mm所需時間，而服藥前后并不影響患者的血壓和心率；在Ⅱb臨床試驗中經過抗心絞痛藥物清除期2周后，125例患者的雙盲試驗也顯示相同結果［24］。

血管痙攣性心絞痛是導致急性冠狀動脈綜合征等缺血性心臟病的主要原因。大量臨床研究結果證明，法舒地爾容易被患者接受且無任何嚴重不良反應，確認新型血管舒張劑-法舒地爾治療穩定型心絞痛的充分有效性和安全性［24－25］。法舒地爾可防止乙酰膽堿誘導的冠狀動脈痙攣，能夠治療血管痙攣性心絞痛患者的心肌缺血［26］，有效治療冠狀動脈旁路搭橋術后的難治性嚴重冠脈痙攣［27］。

最近的臨床研究結果顯示，通過檢測31例患有血管痙攣性心絞痛患者的白細胞ROCK活性的增加，可預測冠狀動脈痙攣性心絞痛的存在和嚴重程度，使用解痙劑治療后這些患者中ROCK活性明顯降低，證明了ROCK在血管痙攣性心絞痛中的發病機制，并確立了白細胞ROCK活性可作為血管痙攣性心絞痛的生物標志物的臨床證據［28－29］。

2.3 糖尿病性外周神經疼痛的治療 糖尿病外周神經病變是糖尿病最常見的慢性并發癥，以肢體疼痛、麻木為突出臨床表現，其中以遠端對稱性、感覺運動性、多發性周圍神經病變最常見。臨床觀察結果表明，鹽酸法舒地爾聯用彌可保治療糖尿病周圍神經病變療效明顯。與治療前比較，患者肢端疼痛、麻木、乏力等癥狀得到明顯改善，總有效率達97.2%，且神經傳導速度明顯改善，在治療過程中無不良反應發生，安全可靠，是糖尿病周圍神經病變的較為理想的治療方法，可有效改善臨床癥狀，提高患者生活質量［30］。

3 結語與展望

綜上所述，Rho／ROCK信號通路在疼痛的產生和持續過程中起重要作用，多項臨床實踐和案例也證明了ROCK抑制劑在預防和減輕疼痛方面的有效性和安全性。研究和開發選擇性更強的新型ROCK抑制劑在臨床鎮痛方面具有重要的意義和廣泛的應用前景，Rho／ROCK信號通路為研究和治療疼痛提供新的思路和策略。

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