N-乙酰半胱氨酸對銅綠假單胞菌的耐藥性及綠膿菌素產量的影響

張亞妮，王世紅，孫 瓊，李 煜

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是院內感染的主要病原菌之一，具有很強的耐藥性。其產生的次級代謝產物綠膿菌素（pyocyanin，PCN），可改變細胞內氧化還原水平，對宿主造成氧化傷害，是導致銅綠假單胞菌感染病人死亡的主要 原 因 之 一［1－3］。N-乙 酰 半 胱 氨 酸 （N-acetylcysteine，NAC）是一種含有巰基的小分子化合物，常被作為抗氧化劑，用來改善細胞內氧化還原水平［2，4］，因此在一些臨床實驗中，NAC被用來治療銅綠假單胞菌感染性疾病。但是，從目前已有的研究可以看出，NAC是否有助于銅綠假單胞菌感染性疾病的治療還沒有一致的觀點，具體機制也并不清楚。在本研究中，為了進一步明晰NAC與銅綠假單胞菌感染性疾病的關系，我們研究了NAC與銅綠假單胞菌的耐藥性和毒性分泌關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 抗生素：卡那霉素（kanamycin sulfate，Kan）、氯霉素（chloramphenicol，Cm）、慶大霉素（gentamycin sulfate，Gm）、紅霉素（erythromycin，Em）購自 Amresco公司；四環素（tetracyclin HCl，Tet）、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、硫酸鏈霉素（steptomycin sulfate，Strep）購自 Genview公司。酵母粉與蛋白胨購自OXOID公司；NAC購自Sigma公司。

1.2 細菌、培養基及培養條件 本研究所用銅綠假單胞菌為實驗室保存的野生型菌株PAO1。LB培養基和PIA培養基按常規方法配置。37℃培養菌體，液體培養時，搖床轉速為 200 r·min－1。

1.3 抗生素抑菌活性測定 抑菌活性測定按照文獻［5］方法，采用瓊脂擴散法測定抑菌圈大小和最小抑制濃度（MIC）兩種方法。

1.4 綠膿菌素（PCN）的測定 按照文獻［6］所述測定。

2 結果

2.1 NAC影響抗生素對銅綠假單胞菌的抗菌活性 NAC配制成50 g·L－1儲備液，過濾滅菌存放在－20℃條件下。在本研究中，選用7種不同的抗生素，分別為Kan、Gm、Cm、Tet、Amp、Em、Strep，這些抗生素可作為一些主要類別抗生素的代表。用濾紙片瓊脂擴散法和MIC法測定NAC影響銅綠假單胞菌對不同抗生素的敏感性變化。結果顯示，在LB培養基中添加1 g·L－1的NAC后，與對照組比較，NAC可以降低銅綠假單胞菌對Gm、Em、Kan和 Strep的敏感性，增加對Cm、Amp、Tet的敏感性。在 1g·L－1的 NAC存在條件下，Kan的 MIC從 120 mg·L－1上升到 480 mg·L－1，Strep的MIC從12.5 mg·L－1上升到125 mg·L－1，而 Cm的 MIC從30 mg·L－1下降到6 mg·L－1，Tet的 MIC從8 mg·L－1下降到 2.5 mg·L－1。

2.2 NAC對銅綠假單胞菌綠膿菌素產量的影響 PCN是銅綠假單胞菌分泌的一種藍綠色次級代謝產物，是重要的致病因子和促炎介質。為了了解NAC對PCN的影響，在銅綠假單胞菌液體培養過程中添加1g·L－1的NAC，發現加NAC的培養液顏色與對照組顏色差別很大，對照組可明顯看到藍綠色的PCN產生，而加NAC的培養液顏色較淡。對PCN的產量進行測定，結果發現，PAO1的平均PCN產量為2.9 mg·L－1，而在培養過程中加 NAC后，PCN產量明顯下降到1.86 mg·L－1。這表明NAC可以降低銅綠假單胞菌的PCN產量。

3 討論

對于NAC等抗氧化劑在治療銅綠假單胞菌感染性疾病過程中，是否起到積極地作用，存在不同的研究結果。銅綠假單胞菌感染的囊性纖維化病人和慢性肺病病人口服和吸入霧化的NAC可以明顯改善肺部和支氣管的感染癥狀［7－9］，改善最大呼氣流速率、最大肺活量和最大呼氣流量容積［10］。但 Decramer等［11］研究認為，NAC對于阻止肺功能惡化和病情加劇是無效的。Stey等［12］對公開發表文獻中2011個口服NAC的病人進行了統計，分析NAC是否有助于病情的緩解及治愈，結果發現，口服NAC可以降低病情加重的風險，改善慢性支氣管炎的癥狀。在本研究中，我們發現NAC對抗生素的抑菌作用有很大程度的影響，并且能夠明顯降低PCN的產量。因此，NAC用于銅綠假單胞菌感染病人的治療應該是有益的，但是與抗生素聯合用藥時，要考慮NAC對不同抗生素抑菌能力的改變。本研究結果為NAC的臨床聯合用藥提供了有力的科學支撐，并為后續研究NAC工作提供一定的思路和參考價值。

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