γ-分泌酶在阿爾茨海默病發病中的作用及與神經型尼古丁受體關系

任家謀 齊曉嵐 官志忠

(貴陽醫學院分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(AD)是一種最常見的人類中樞神經系統的退行性病變，臨床上將其定義為進行性認知功能的喪失和從中年期到晚年期緩慢發生的進行性記憶損傷〔1〕。病理學上以細胞外老年斑(SPs)形成及神經細胞內神經元纖維纏結(NFTs)為主要特征〔2〕，還伴有顆粒空泡變性(GD)、平野小體(HB)、神經元減少等〔3〕。本文就AD的發病機制及研究現狀、γ-分泌酶在AD發病中的作用、神經型尼古丁受體與γ-分泌酶的關系及神經型尼古丁受體在其中的作用做如下綜述。

1 AD的發病機制及研究現狀

在歐美發達國家及我國，AD發病有增多的趨勢。一般在65歲左右時，AD的發病率約為2%～5%，年齡75歲左右時，發病率約為10%，年齡到90歲時，AD發病率可高達35%～40%〔4〕。目前認為AD是由遺傳學因素、環境因素和代謝因素等多種因素共同作用所引起的一種病理過程，涉及多種機制。

1.1β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常沉積 AD的特征性病理標志之一是SPs形成。SPs主要是Aβ包括Aβ40和Aβ42沉積的結果〔5〕。因此腦內Aβ的產生、聚集和沉積被認為是AD發病機制的首要和中心環節。Aβ由淀粉樣蛋白前體 (APP) 經過β和γ-分泌酶連續的蛋白酶裂解產生。γ分泌酶組分早老素(PS)包括PS-1和PS-2突變導致APP水平增加或APP裂解改變使Aβ超量產生是引起家族性早發AD的主要原因〔6〕。

1.2Tau蛋白異常磷酸化 Tau蛋白的高度磷酸化在促進AD患者神經細胞退行性變中起著關鍵作用〔7〕。Tau蛋白是一種含磷的蛋白質，正常成人Tau蛋白中磷酸含量為2～3 mol/g，而在 AD 患者中，Tau白蛋被異常過度磷酸化從而使Tau蛋白的磷酸含量增高至5～12 mol/g〔8〕，是正常含量的3～4倍。高度磷酸化的Tau蛋白可抑制微管蛋白的裝配和降低神經元的運輸效率，在AD的發生機制中有重要的作用〔9〕。

1.3膽堿能功能降低 乙酰膽堿(ACh)為促進學習記憶的神經遞質。AD患者腦組織中膽堿能神經元數量減少，膽堿能受體密度降低，膽堿能活性與SPs數量呈負相關〔10〕。臨床上用抗酯解酶藥物降低膽堿酯酶的活性的活性來提高ACh的水平，可改善AD患者記憶力降低和定向障礙等癥狀〔11〕。DeKosky等〔12〕通過對輕度認知障礙(MCI)輕、中度AD患者和正常人腦內多個區域ChAT活性測定發現，MCI和AD患者ChAT水平與正常人無明顯差異，僅在AD晚期ChAT水平降低。

1.4自由基學說 研究表明，AD患者大腦中自由基水平上升，包括超氧化物陰離子自由基、過氧化氫、脂質過氧化物和自由羰基等含量增加〔13〕。體外研究指出，活性氧促進Aβ的毒性和聚集，而Aβ也是自由基生成增多〔14〕。體內研究也表明，Aβ的沉積誘導自由基的產生，Aβ的神經毒性作用很大程度上由自由基所介導，而自由基增多又極大地促進了Aβ的沉積，造成一種神經細胞受損和功能紊亂的惡性循環狀態〔15〕。

1.5生物膜性脂質和膽固醇代謝的改變 有研究結果指出AD患者腦組織神經膜中的神經節苷脂含量明顯減少，其減少程度與神經元的喪失和神經元面積縮小有關〔16〕。近年研究表明，高膽固醇可增強APP代謝過程中β分泌酶的活性，使APP產生Aβ增多，降低膽固醇水平可使α分泌酶活性增強從而減少Aβ的生成〔17〕。既往的研究也表明使用降膽固醇合成藥-司汀類藥(statins)可上調細胞中α7尼古丁受體并具有神經保護作用〔18〕。因此，生物膜脂質的異常改變和膽固醇代謝改變與神經元的形態功能變化以及神經元的死亡有關，是AD發生、發展機制中不可忽視的重要因素之一。

2 γ-分泌酶在AD發病中的作用

引起AD發病密切相關的酶即 Aβ的代謝需要三種關鍵酶： α，β，γ-分泌酶。APP由α分泌酶Aβ區域內部Lys16-Leu17之間的肽鍵，產生分泌型的APP(sAPPβ)和C83片段，而C83片段又在γ-分泌酶的作用下產生較小的具有神經毒性作用的P3和胞內片段AICD，此為非淀粉樣肽源性途徑。而淀粉樣肽源性途徑則是由β-分泌酶裂解APP分子β部位的第一個氨基酸之前的肽鍵產生sAPPα和C99片段，再由γ-分泌酶切開C99片段中39～44之間的肽鍵，產生不溶性的完整的Aβ1～42/43，含有39～43個氨基酸。γ-分泌酶是產生Aβ的最后一步，對調節產生Aβ40 和Aβ1～42起著關鍵的作用〔19〕。Farfara等〔20〕首次證明γ-分泌酶在AD中具有雙重作用。一種作用是裂解APP產生Aβ，另一種是調控小膠質細胞以清除Aβ的積聚及其神經毒性。研究表明，PS是γ-分泌酶亞族的催化劑，PS1與PS2能夠減少小膠質細胞活性，二者和γ-分泌酶抑制劑一樣能夠抑制小膠質細胞基因表達，蛋白水平和遷移能力，這些變化也會降低可溶性Aβ的吞噬作用。所以目前該酶被認為是開發AD藥物的重要靶點。

γ-分泌酶分子量約為200～250 kD，酶切位點位于低位的跨膜片段中間，生物化學研究表明γ-分泌酶復合體由早老蛋白(PS)，單過性跨膜蛋白(NCT)，整跨膜蛋白APH-1和PEN-2四部分組成〔21〕。

廣泛表達定位于內質網和高爾基體腔隙的PS是γ-分泌酶活性所必需的，包括同源性為67%的兩種同源異構體PS1和PS2。含有γ-分泌酶活性的催化位點的PS-1是由467個氨基酸組成的約為50 kD的整膜蛋白，由8個跨膜結構區域(TM)和一個大的親水性環構成。TM6和TM7中各有一個保守的天冬氨酸。PS-1在TM6和TM7之間的細胞溶質環內水解形成相互關聯的兩部分：28 kD的N-端片段(NTF)和18KD的C-端片段(CTF)。每一部分貢獻一個Asp活性位點形成γ-分泌酶活性中心。PS全蛋白(PS)是無活性的前體，水解后的NTF和CTF形成PS異二聚體具有活性，這與該酶的酶切位點位于APP的跨膜區是一致的〔21〕。

提高PS的表達并不能提高γ-分泌酶活性，因為PS含量的變化受到多種因素的影響例如Notch的反饋調節，所以在研究γ-分泌酶活性過程中單純地測定PS的表達量并不能代表酶活性的變化〔22〕。Esler等〔23〕研究發現PS的異二聚體和NCT都特異性地結合γ-分泌酶抑制劑并且和γ-分泌酶活性有關，表明NCT也是影響γ-分泌酶的活性因素。抑制NCT的表達，會導致減少PS的CTF的形成和APH-1和PEN-2的表達，增加APP的C端片段，減少Aβ的生成。

跨越7個跨膜區的整膜蛋白APH-1，分子量約為30 kD。研究表明，過分表達的APH-1和NCT能形成穩定的而無活性的γ-分泌酶高分子復合體。通過對APH-1的氨基酸序列對比，發現APH-1在TM4中含有一個保守的氨基酸序列，用Asp取代首位的Gly將會使APH-1產生失去功能的突變，影響-分泌酶復合體的活性，表明TM4中小的疏水結構的Gly促進生成活性γ-分泌酶復合體〔24〕。

PEN-2是一個有101個氨基酸組成的發夾樣的整膜蛋白，分子量約為12 kD，有兩個疏水的跨膜區，在切割各種Ⅰ型跨膜蛋白有重要的作用。PEN-2的N端和C端與γ-分泌酶復合體的各組成部分在內腔相互作用，包括NCT的外功能區，PS和APH-1的細胞外環。PEN-2的C端與PS相互作用，促進NCT成熟和PS的內切蛋白酶解，促進Aβ分泌〔25〕。

龍志敏〔26〕取成年癡呆小鼠的腦組織進行r免癥熒光雙標，結果顯示：癡呆小鼠腦部各區均出現大量的Nct陽性細胞(綠色熒光)和Aβ陽性細胞(紅色熒光)，但在大腦皮質和海馬內NCT陽性神經元的數量要多于Aβ陽性細胞，且在一些神經元內NCT與Aβ出現共存。免疫熒光雙標結果顯示：PS1在成年雙轉基因癡呆小鼠腦組織的分布趨勢同NCT高度一致。不同的是，在神經元內PS1免疫陽性物在胞質表達較強，而NCT免疫陽性物在胞漿、胞膜均有強表達。

3 神經型尼古丁受體在AD中的作用及與γ-分泌酶的關系

神經型尼古丁受體(nAChR)與很多大腦功能有關，在AD的發病中占有重要的作用。通過對AD患者的正電子發射圖譜(PET)研究發現，在疾病發生的早期即出現特異性的尼古丁受體減少，這與AD患者認知功能關系的改變有著密切關系〔27〕。研究表明在AD患者的大腦皮層的nAChR的含量明顯減少〔28〕。Guan等〔29〕研究也發現Aβ25-35和Aβ40均可抑制體外培養細胞中尼古丁受體基因的表達,還調節多種其他受體的功能，并具有對抗神經細胞毒素性神經保護作用〔30〕。已經證實患者腦組織多個區域中尼古丁受體水平降低〔26〕。受體結合實驗發現AD患者大腦尼古丁受體密度降低，與大腦顳葉皮質SPs的增多程度呈負相關。

Paterson等〔31〕報道AD患者腦中高親和力的尼古丁受體數目明顯的下降，在以后的尸檢和活檢中也發現了尼古丁受體的明顯降低。AD患者腦組織中nAChR水平明顯降低，該受體在 AD的發生發展中起重要作用。研究表明α7 nAChR功能與大腦學習和記憶能力有關，并具有明顯的神經保護作用〔32，33〕。

在研究中發現，AD病人尸解后腦組織中，海馬和大腦皮層區域尼古丁受體a4亞單位蛋白質水平分別較同齡對照組降低了35%和47%；α3亞單位分別降低29%和35%；α7亞單位亦有明顯降低；但β2亞單位與對照組相比無明顯的差異。很多實驗也得到相似結果〔34，35〕。我們的研究顯示，經Aβ腦室注射的大鼠腦組織中，尼古丁受體α7亞單位較對照組明顯降低，說明 Aβ1～42能夠引起α7亞單位蛋白水平表達降低。

nAChR亞單位除了與大腦的學習和記憶功能有關外，還具有明顯的神經保護作用〔27〕。大量研究表明，神經遞質性受體與APP的代謝過程有密切聯系，在AD的發病中起著重要的作用〔36〕。其中α7nAChR與AD的發生關系密切，具有明顯的神經保護作用，但其神經保護作用機制并不清楚。在APPSWE轉基因大鼠腦標本中可見α3nAChR的選擇性升高，提示α3nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護機制。

4 結 論

目前的研究已經證實尼古丁受體與很多大腦功能有關，而AD發生時有上述功能的損害并有nAChR數量的減少和表達的低下，因此可以說在AD的發生和發展中nAChR起著重要的作用。在Aβ代謝過程中的關鍵酶即γ-分泌酶是Aβ代謝的關鍵酶，是其代謝的最后一步，也是產生不溶性片段的關鍵酶，而目前對Aβ的代謝水平研究上γ-分泌酶的研究比α和β分泌酶更有前景，所以γ-分泌酶的研究是為AD的治療提供新的靶點。

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