膀胱癌干細胞標記物的研究進展

王海明 石愛平 許 寧

(吉林大學第一醫院泌尿外科，吉林 長春 130021)

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤之一，可以直接威脅患者的生存。在全球范圍內，膀胱癌發病率排在惡性腫瘤的第11位，在我國，膀胱癌發病率低于西方國家，但近些年來的發病率有增高的趨勢，嚴重威脅著患者的健康〔1〕。盡管當前在膀胱癌的治療上有了很成熟的治療方案，但對于其復發和轉移仍無好的方法，人們一直在尋找治療膀胱癌的新方法。10多年前，Reya 等〔2〕提出的腫瘤干細胞(CSCs)學說中提示腫瘤干細胞是維持腫瘤生長、復發以及轉移的根源所在，為探索腫瘤治療的新途徑提供了依據。隨著對干細胞研究的深入，干細胞在臨床應用上的作用越來越受到重視。膀胱癌干細胞(BCSCs)是一類膀胱組織中具有多向分化潛能的特殊細胞，被認為是膀胱癌發生的啟動細胞，可以誘發腫瘤的形成，BCSCs的研究在了解膀胱癌的發病機制及診療中發揮重要作用，可以為新的診療思路提供依據，而膀胱癌的特異性標志物是BCSCs研究的關鍵之一。不同組織來源的干細胞表達不同的標志物，但有些表面標志物卻在不同的干細胞中均有表達。當前研究的CSCs分子標志物并不是特異性的標志物而僅僅是相關的標志物。目前國內外BCSCs標志物的研究較少，本文著重對用于BCSCs的標志物進行綜述，以期進一步加深對BCSCs的認識，為膀胱癌新的診療方案提供幫助。

1 常用的BCSCs標志物

1.1細胞表面分子標志物 目前研究中常見的腫瘤分子標志物有CD44、CD47、CD20、CD5、CD133等，而CSCs表面標志物并不是特異性的標志物，而只是一些相關的標志物，如表面標志物CD44+/CD24-/low已證實是乳腺CSCs的標志物〔3〕，CD133+已證實是肺〔4〕和腦〔5〕等實體CSCs標志物，但這些表面標志物也可以是BCSCs表面標志物。

1.1.1CD44 CD44屬于黏附分子家族的一員，是一種存在于細胞表面的跨膜糖蛋白，近年來的研究發現CD44有標準體(CD44S)與變異體(CD44V)兩種，與腫瘤的生長和轉移有密切關系。CD44分子有廣泛的生物學功能，如細胞表面分子，參與細胞增殖、細胞分化及細胞遷移；參與細胞因子、趨化因子和生長因子等相應受體的表達以及重要的細胞信號轉導。Wood ward等〔6〕已證實CD44是造血系統腫瘤、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的CSCs相對特異性標志物。CD44是公認的細胞表面標志物，CD44+細胞位于正常尿道上皮及尿路上皮癌的基底層，幾乎常規用于確認膀胱癌。Chan 等〔7〕基于CD44+、CK5+及CK20-分離和鑒定原發性膀胱癌啟動細胞亞群，進一步證實此亞群細胞豐富的致瘤能力，可誘導裸鼠成瘤。另外，對300例膀胱癌患者CD44的表達分析顯示，有約40%CD44+的亞群腫瘤細胞。CD44+細胞亞群誘導腫瘤的效力是表型相同異種移植模型的10～200倍，由此確認它們的腫瘤起始能力，證實了CD44+的高表達，具有高致瘤性，可作為BCSCs的分選標志物。Yang 等〔8〕通過磁性細胞分選和細胞培養方法證明：CSCs表達CD44的變異亞型(CD44v6)和上皮膜抗原(EMA-)，在膀胱癌組織中，EMA-CD44v6陽性細胞數約占癌癥細胞的30%；體外細胞單克隆實驗分析表明，這些細胞具有較高的自我更新能力與親代腫瘤有相同的克隆能力。由此可以證明CD44v6+和EMA-的干細胞具有細胞集落形成、自我更新和增殖能力，所以認定CD44v6+和EMA-是BCSCs的表型，可能是BCSCs分選標志物。2013年Zhu等〔9〕利用MB49膀胱癌干細胞株(MCSCS)通過流式細胞(FACS)分析證明CD44+和CD133+高表達于MCSCS；利用定量PCR技術分析比較證實OCT4、CD44、CD133和NANOG高表達于MCSCS。因此，CD44可能作為MCSCS表面標記物之一。

1.1.2CD133 CD133又名prominin 1，是一種細胞表面黏附分子，是一種由5個跨膜結構域的N-糖基化的胞外環組成的跨膜糖蛋白，雖然其功能尚不清楚，但隨著細胞的分化，CD133隨之下調，所以常被應用于干細胞的分離鑒定。Pellacani 等〔10〕證實CD133可作為前列腺癌的干細胞標志物。Zhu等〔9〕利用MB49 MCSCS通過流式細胞(FACS)及定量PCR技術分析證明CD133+高表達于MCSCS。Bentivegna等〔11〕收集了49例膀胱癌電切組織樣本，經染色后通過免疫熒光分析及細胞遺傳學分析，分離出CD133高陽性表達的細胞，通過免疫組化及裸小鼠移植實驗成功鑒定了此細胞為BCSCs。所以CD133也可以作為BCSCs的分選標志之一。

1.1.3CD47 CD47也稱為整合素相關蛋白(IAP)，存在于細胞表面，屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，可對巨噬細胞的吞噬功能有抑制作用，CD47的表達與腫瘤免疫及預后相關，隨著對其研究的深入，CD47將在腫瘤的治療中發揮重要作用，有廣闊的前景。Chan 等〔12〕利用CD47+/CD5+/CD20-分選出BCSCs，發現CD47在膀胱癌細胞中廣泛表達，CD47在BCSCs的特異性增加并也顯著表達，CD47可與巨噬細胞表面受體SIRPα結合，阻斷巨噬細胞的吞噬，證明了CD47可能是膀胱癌治療的靶點。因此，CD47可能作為一類BCSCs的分選標志物。

1.2乙醛脫氫酶1 乙醛脫氫酶(ALDH)是一系列氧化各式各樣醛類轉變為相應酸的酶。近年來的研究表明〔13〕人體細胞內的ALDH1可能在干細胞生物學方面發揮重要作用，已被用作一個標記，用來識別和分離干細胞或者癌干細胞。ALDH1A1是ALDH1家族的主要成員，Ginestier等〔14〕研究表明，ALDH1A1是乳腺CSCs的標記物，其表達與腫瘤的分期、分級和預后不良相關。Su等〔15〕利用ALDEFLUOR及流式細胞分選(FACS)從人膀胱癌細胞系中分離出ALDH1 A1+細胞，通過體外體內實驗表明，ALDH1 A1+膀胱癌細胞與ALDH1 A1-癌細胞相比具有更高的致瘤性，ALDH1A1表達降低后，致瘤性也隨之降低，ALDH1A1+膀胱癌細胞可在體內連續傳代、移植，導致了異質細胞群，該ALDH1A1+膀胱癌細胞可以代表膀胱癌中的CSCs。另外，Su課題組還利用免疫組織化學(IHC)的方法對臨床標本的分析發現，預后不良的患者與ALDH1A1的高表達有顯著的關聯，因此，ALDH1A1可能是膀胱CSCs相關的功能標志物，并可能是膀胱癌的惡性進展和預后不良的因素。近期，國內張海濤等〔16〕應用免疫組化的方法對非浸潤性膀胱癌組織和癌旁正常膀胱組織的ALDH1的表達進行檢測，發現在非浸潤性膀胱癌組織中，ALDH1的表達高于正常膀胱組織，證實了其與非浸潤性膀胱癌的病理分級、分期及腫瘤復發相關聯。此外，新出現的證據表明，ALDH1不僅是一個標志物用于干細胞的標記，其也可以起到自我保護、分化和擴展功能的重要作用。

1.3細胞角蛋白 細胞角蛋白(CK)是一類主要骨架蛋白，存在于上皮細胞中的角質細胞中，當前已有20多種CK已得到了證實。CK的表達某種程度上反應了細胞分化，可作為一種常用的腫瘤免疫組織化學標記物。Chan 等〔7〕證實了CD44+細胞中不表達CK20，可以應用CD44+/CK5+/CK20-分離BCSCs。He等〔17〕證實可應用CK17+/CK18-/CK20-/CEAM6-來分離鑒定BCSCs。另外，Ck17是存在于尿路上皮基底細胞，有很強的成瘤能力，其在SW780細胞株具有較強的表達形成的腫瘤細胞，CK17+常聯合67 kD層黏連蛋白受體(67LR)陽性的腫瘤細胞，而排斥的CD66C，通過檢測67LR細胞基因表達，顯示在Wnt信號傳導相關基因高表達于67LR明亮的細胞，證明了67LR+/CEACAM6-/CK17+可以應用于分離鑒定BCSCs。目前的研究表明CK20、CK17、CK18、CK5和67LR等被認為可能是BCSCs相關的標志物。

1.4OCT-4 Oct-4也稱為POU5F1基因，是一個關鍵的胚胎干細胞調控因子，能夠自我更新和分化。OCT-4主要定位于腫瘤細胞的細胞核，OCT-4已被引入作為分子標記用于生殖細胞腫瘤。Atlasi 等〔18〕用免疫組化、半定量RT-PCR方法和Western印跡等方法確定了OCT-4幾乎在全部檢測的膀胱癌組織標本中表達，但是，低表達于癌旁組織及正常膀胱組織標本。Zhu等〔9〕利用定量PCR技術及Western印跡證明OCT-4在自我更新中發揮了顯著作用，被確定為關鍵分子，在蛋白質水平和mRNA轉錄物水平維持自我更新和分化，OCT-4的大量表達表明OCT-4基因有可能導致腫瘤的發生，并與某些癌癥的耐療法或癌癥復發密切相關。Bentivegna 等〔11〕從49例電切樣本組織分選出OCT-4高表達的干性細胞，并證明了膀胱癌患者組織中存在CSCs樣群體。所以，全能干細胞標志物OCT-4可作為BCSCs的標志物，它們的表達也與腫瘤的發生、復發或抗性的治療方法密切相關。

1.5Nanog、Bmi-1 Nanog屬于ANTP類NK家族基因，是一種具有自我更新的關鍵調節基因；BMI-1又稱為干細胞更新因子，是一種自我更新的原癌基因。研究證實〔19〕Nanog和Bmi-1基因已被證明在某些類型的CSCs中發揮作用，表明這些調節基因的功能是CSCs自我更新和腫瘤發生的至關重要因素。王衛生等〔20〕通過檢測人膀胱癌組織中Nanog調節因子的表達，證明干細胞標記基因Nanog在膀胱癌組織中少許表達，這些細胞可能是BCSCs，為BCSCs的分離鑒定提供了依據。Zhu等〔9〕證明Nanog是膀胱癌分化的關鍵分子，在蛋白質水平和mRNA轉錄物水平維持自我更新和分化，Nanog的大量表達表明其與腫瘤耐療法及癌癥的復發相關。Zhang等〔21〕選擇表達Nanog和Bmi-1等干細胞基因的患者的膀胱癌組織，利用免疫組織化方法檢測表明，Nanog和Bmi1的在膀胱癌中的高表達與病理高分級相關。高表達Nanog和Bmi-1的細胞可能代表了一類干細胞樣的細胞群，可能作為腫瘤中的潛在的生物標志物，與預后相關聯。

1.6ABCG2 ABCG2屬于ABC超家族，是側群(SP)細胞的特異性標志物，可用于SP細胞的分離鑒定，作為一個標記用于干細胞的研究。ABCG2是決定SP細胞分子表型的重要蛋白。Zhu等〔9〕利用MB49 MCSCS通過Western Blot證明ABCG2在MCSCS中大量表達。Hepburn等〔22〕對148例非浸潤性膀胱癌樣品中進行ABCG2表達的研究，結果表明ABCG2轉運蛋白主要在SP側群中表達和上調，SP細胞中ABCG2的表達為非SP細胞的3倍，ABCG2高表達的側群可以作為干細胞的標記，在腫瘤集落形成效率上是ABCG2低表達的3倍；在體內，ABCG2 高表達的SP細胞腫瘤富集生長與CSCs是一致的。ABCG2可以作為一類干細胞標記，其高表達的SP細胞在人類非浸潤性膀胱癌和MAPK / ERK信號通路中是一個可能的治療靶點。

1.7MAGE-A3 1991年van der Bruggen等〔23〕首次分離出黑色素瘤抗原(MAGE)，根據在染色體分布的不同部位，將其分為A、B、C、D、E、F六個亞科，黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)作為MAGE家族中的一員，多在黑色素瘤表達，在不同類型的腫瘤組織中也廣泛表達，但罕見表達于正常的組織(除睪丸和胎盤細胞)。該抗原不但可被相應的MHC Ⅰ類分子呈遞，并且能夠被HLA Ⅱ類分子遞呈給CD4+T或CD8+T細胞，可使機體產生針對表達MAGE-A3腫瘤的細胞免疫。目前研究報道〔24，25〕在肺癌、食道癌、原發性肝癌、頭頸部鱗癌、結腸癌、鼻咽癌等惡性腫瘤中都陽性表達MAGE-A3。殷波等〔26〕利用RT-PCR技術、免疫熒光雙標記技術及Western印跡技術測定MAGE-A3在BCSCs中的表達情況，檢測了BCSCs的標志物CDl33在T24側群細胞中的表達情況，及其與MAGE-A3的共表達情況，MAGE-A3和CDl33在T24側群細胞中具有陽性共表達，并證實了這些側群細胞為BCSCs。所以，MAGE-A3有望成為BCSCs一個新的特異性的標志物。

2 BCSCs標志物在膀胱癌的診療中的應用研究

目前針對膀胱癌患者的術后輔助治療還是傳統的放化療及免疫治療方法，由于治療的盲目性及對藥物的耐受，膀胱癌的復發和轉移并沒有得到根本的解決。最近，從各種人類惡性腫瘤分離出的CSCs的特點表明，CSCs耐受放化療〔27〕，CSCs可能是復發轉移的根源，同時也是干預治療的理想靶點。Hepburn等〔22〕認為ABCG2可以將化療藥物代謝轉運出細胞外，干擾化療藥物的療效。Chan 等〔7〕研究發現CD47可與巨噬細胞表面受體SIRPα結合后，阻斷巨噬細胞的吞噬功能，阻斷CD47能夠在體外增加巨噬細胞吞噬膀胱癌細胞的能力，用抗CD47單克隆抗體可阻斷體內的轉移，CD47有望成為膀胱癌治療的新靶標。BCSCs標志物與膀胱癌的發病機制診療及預后密切相關，利用BCSCs的特異性標志物，探索一種選擇性殺滅BCSCs的個體化診療方案并聯合傳統的治療方案，將是一種膀胱癌治療的新思路新方法。

綜上所述，BCSCs標志物在膀胱癌的發病機制、抗復發療法中發揮重要作用，盡管一些潛在的干性標志物在膀胱癌中已經確定，但并非特異性的標志物，這些標志物還經常在正常膀胱干細胞或祖細胞中檢測到，因此，需要探索更特異的標志物或者聯合多種標志物對BCSCs進行標記示蹤，已實現針對CSCs的靶向治療，為癌癥復發、耐藥的研究及開辟新的臨床治療領域提供更多理論依據。

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