肌萎縮側索硬化的基因治療

陳章洲 徐仁伵

(吉安市泰和縣人民醫院內科，江西 泰和 343700)

肌萎縮側索硬化(ALS)是一種進行性神經變性疾病，由于上、下運動神經元變性導致延髓、四肢、軀干等部位肌肉逐漸無力和萎縮，確診后3～5年患者多因呼吸肌麻痹而死亡，目前尚無有效的治療方法。利魯唑(riluzole)為谷氨酸拮抗劑，可使ALS患者的生存期平均延長3 個月以上，是目前唯一被美國FDA 批準的臨床藥物。其他的治療措施還包括維生素、神經營養因子及干細胞移植等，但都沒有確切效果。基因治療為治療ALS提供新的治療策略。

1 ALS發病機制

雖然ALS有特定的致病基因，但其發病仍與多種因素的互相影響有關。大約20%的家族遺傳性ALS(fALS)與銅/鋅超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突變有關，約5%與編碼TDP-43蛋白的TAR DNA結合蛋白(TARDBP)基因突變有關。近年來研究發現了更多與ALS患者相關的基因突變，如血管生成素(ANG)基因、囊泡相關膜蛋白相關蛋白B(VAPB)基因和脂肪肉瘤融合(FUS/TLS)基因〔1，2〕。不論散發性ALS(sALS)是否存在上述基因突變，但都有共同的病理特征，即運動神經元選擇性死亡、氧化應激、神經纖維異常、興奮性氨基酸毒性、細胞凋亡、線粒體功能障礙、軸突運輸障礙、RNA結合蛋白的基因突變和炎癥因素都在ALS發病過程中起到作用。近年來，由于神經遺傳學研究的進展，ALS發病機制的進一步闡明，導入外源性基因載體的改進及其基因轉移技術的進步，使基因介導的治療正逐步實現。

2 基因治療的靶向選擇

2.1星形膠質細胞 盡管在ALS中選擇性易損細胞為運動神經元細胞，但星形膠質細胞可激發運動神經元的凋亡及炎癥反應〔3～5〕，在疾病的發展過程中也起到調節作用。降低星形膠質細胞中谷氨酸轉運體水平可以導致ALS患者谷氨酸攝取障礙及繼發的興奮性毒性作用。興奮性氨基酸受體(EAAT2)主要表達于星形膠質細胞，而EAAT2被抑制則是運動神經元細胞興奮性毒性的一個原因。在體外培養的研究中，大量表達EAAT2可以顯著增加谷氨酸的攝取率及提高運動神經元神經保護作用。SOD1小鼠的EAAT2增加可延緩其運動神經元細胞的丟失，若受體減少則在早期即表現出運動神經元細胞的丟失〔6〕。由此可見增加膠質細胞谷氨酸受體的表達有助于ALS的治療。盡管此結論在目前基因治療領域并未應用，但通過在病灶區增加正常星形膠質細胞以清除過量谷氨酸的細胞治療方式已被推薦〔7〕。

2.2神經肌肉接頭 因為終板的失神經支配為ALS的最初變化之一〔8〕，在早期即著眼于神經肌肉接頭則成為保證運動神經元間聯系的重要方式〔9，10〕。對初生的SOD1轉基因小鼠肌內注射以腺病毒為載體整合的心肌營養因子-1，可延緩神經肌肉變性。同樣體外神經膠質細胞源性的神經營養因子(GDNF)的肌肉注射，在SOD1轉基因小鼠疾病中期階段亦可增加神經肌肉連接和運動神經元數量〔11〕。近期有研究證明對初生轉基因小鼠進行全身肌肉注射表達抗SOD1的腺病毒相關載體AAV6，可阻止肌肉萎縮但不能阻斷疾病的進展〔12〕。

綜上所述，對于ALS要同時針對脊髓(如運動神經元細胞及膠質細胞)和骨骼肌(如神經肌肉接頭)進行治療才有可能更全面得阻止運動神經元的變性。

3 動物模型

目前以嚙齒類動物為模型的研究已廣泛開展，雖然已有可延長動物存活期及阻止神經元丟失的報道，但治療與動物模型的相關性仍存置疑，因為絕大多數干預都在動物發病以前進行，而ALS患者卻已有明確臨床表現。除了現已熟悉的SOD轉基因小鼠，動物模型也需要多元化。目前已有以豬作為SOD轉基因的大動物模型，另也存在類似于ALS患者延髓麻痹的自發性喉部麻痹的犬類〔13〕及存在SOD1基因錯義突變的脊髓變性犬類亦可作為ALS可能的大動物模型，這些多元化的動物模型有利于進行ALS包括基因治療的在內的各項研究。

4 給藥途徑

基因治療的途徑分為體外細胞介導法(ex vivo)和體內直接轉染法(in vivo)。ex vivo是指將含外源基因的載體在體外導入人體自身或異體細胞(或異種細胞)，經體外細胞擴增后，輸回人體，此途徑比較經典、安全，而且效果較易控制，但是步驟多、技術復雜、難度大，不容易推廣；in vivo 途徑是將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體，直接導入體內。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。此途徑操作簡便，容易推廣，但目前尚未成熟，存在療效持續時間短，免疫排斥及安全性等一系列問題。

ALS基因治療的療效與以何種方式將轉基因物質充分轉染運動神經元細胞直接相關，而且其組織內分布的彌散程度也決定了可能達到的最佳療效。事實上，在ALS基因治療的臨床實踐中，以何種途徑可以將安全有效的基因轉遞至脊髓運動神經元，且呈彌散性分布，仍是一極大的挑戰。

近年來已有不少有關于ALS基因治療給藥途徑的研究。但在鼠類行之有效的非侵入性肌肉注射和神經內注射在大動物模型中并未得到放大驗證，這可能與轉運載體無效和基因在脊髓的表達有限相關。目前已有研究證明對猴子行肌肉注射AAV6介導的基因后可得到大量的表達〔14〕，但對已累及遠端軸索的患者是否可行仍待考究。另外可將基因更直接地轉移至脊髓的椎管內注射，雖然在野生型SOD1動物中已卓有成效〔15，16〕，但尚未得到臨床驗證。有學者正在對ALS患者椎管內注射進行1期臨床研究，不過安全性問題仍阻礙了其發展〔17〕。因肌肉、神經、椎管內注射途徑均不能將基因轉移至整個脊髓，僅僅可作為局限性基因傳遞方式。

當前ALS基因治療的研究主要集中在以腺病毒為載體的AAV9，它可經靜脈或鞘內注射通過血腦屏障且對運動神經元有一定的選擇性〔18～20〕。另外還有一些學者〔18，21～23〕在大動物模型中研究以這種載體及其彌漫性非侵入性注射后的基因表達情況。

5 外源基因及載體

5.1神經保護作用 目前已證實對嚙齒類ALS動物模型中瀕死運動神經元細胞進行保護可延長其存活期，這也是有關ALS治療研究的前提。但對于ALS患者進行全身注射腦源性神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)或類胰島素樣生長因子(IGF)-1卻無獲益〔24，25〕。可能與注射的不恰當或不足量致其失活或縮短其半衰期有關。但以基因轉染方式給予神經營養因子則是更有效的方法。

5.2病毒載體轉運膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、IGF-1、血管內皮生長因子(VEGF)等 AAV和慢病毒載體能作用于非分裂相細胞，而且能與宿主細胞基因組發生整合。以病毒介導基因轉染的方法為一種中樞神經系統退行性病的潛在治療方案，目前已有學者〔26～28〕在對帕金森病及阿爾茨海默病進行臨床實驗，以評估此方式轉遞神經營養因子的安全性及治療前景。動物模型中分泌的神經營養因子可保護疾病狀態下的運動神經元細胞并延緩病程發展的大量論證是對ALS患者以基因方式轉染神經營養因子進行治療的理論基礎。在sALS嚙齒類動物模型中有大量成功的案例證明病毒介導轉染GDNF、IGF-1和VEGF對運動神經元有保護作用。這些SOD1轉基因動物模型的性狀與ALS患者的臨床表現類似。而用以轉染靶細胞的神經營養因子對SOD1鼠起病時期及病程進展的推遲程度，或多或少與其給藥途徑有關。

研究表明，發育及成熟運動神經元對BDNF、人神經營養因子(NT)-3、NT-4/5有反應，BDNF、NT-3增加培養胎大鼠運動神經元的活性,BDNF可防止運動神經元的自然死亡,并對損傷的新生大鼠面部運動神經元有保護作用,當神經切斷后BDNF、NT-3逆行運輸刊運動神經元急劇增加。外源性BDNF能延遲自然發生運動神經元的運動失能，減輕神經肌肉萎縮和運動軸突消失。

基于軸索逆向運輸原理，肌肉注射方式廣泛應用于病毒介導的神經營養因子的轉染中。有研究證明在SOD1小鼠中肌肉注射AAV2-IGF1可延緩病程、延長存活期，而肌肉注射的慢病毒介導VEGF的療效在同樣的動物模型中也得到證明〔29〕。近年也有學者〔15〕發現椎管內注射AAV2-IGF1可起到部分神經保護作用，但尚未證明可延長存活期。

相比效果甚微的利魯唑，這種方法需要起到多大效果方可應用于臨床前實驗仍還是個問題〔30〕。因為ALS患者迫切需要更有效的治療，所以治療的發展存在很大的市場機遇，盡管如此，大規模地將動物模型從嚙齒類向大動物轉變仍成為脊髓基因治療的一大障礙。目前MoNuDin仍為ALS患者基因治療臨床前試驗階段的唯一方式。

5.3抗凋亡蛋白 凋亡是ALS發病機制的一個因素，所以在阻止神經元細胞死亡的研究中抗凋亡亦倍受關注。已有研究證明在體外和SOD1小鼠轉染Bcl-xl和Bcl-2這類具抗凋亡作用的基因，對運動神經元細胞的保護作用〔31〕。然而盡管這一結論在一些試驗中得以證實但并不能代表其在基因治療中的進展，仍待長期的深入研究。

5.4基因沉默 基因沉默是指生物體中特定基因由于種種原因不表達或者是表達減少的現象。外源基因進入細胞核后根據其作用機制和水平不同可分為三種：位置效應、轉錄水平的基因沉默和轉錄后水平的基因沉默。

多數ALS 是由編碼SOD1基因顯性突變引起的，理論上可以通過基因沉默的方法治療。RNA 干擾(RNAi) 技術是一種轉錄后基因沉默方法，可以下調蛋白的表達。在體外培養的細胞中 RNAi 能發揮很好的作用。將穩定的小干擾RNA(siRNA) 注入腦脊液中仍能敲除50% 的靶mRNA。表達了基因沉默siRNA的病毒載體已被用于治療ALS 動物模型，但并未延長生存期。

有研究發現當抑制小膠質細胞中突變基因的表達時，可顯著降低發病后疾病進展速度。雖然目前已有大量研究為成功選擇SOD1等位突變的基因沉默提供切實證據，但在選擇性敲除星形膠質細胞、運動神經元細胞或是肌細胞中的SOD1突變基因后,仍無法說明ALS的發病機制或分辨不同細胞在病因學的作用。此外，病毒介導的SOD1基因沉默雖然可延長SOD1小鼠的壽命〔32，33〕，但全身注射并不能證明可防止病情惡化〔34〕。近年來對新生小鼠肌肉注射AAV6、shRNAs、SOD1也未能阻止病情發展〔34〕。盡管如此，Isis制藥公司已對一種以反義寡核苷酸為基礎可抑制SOD1產生的藥物-ISIS-SOD1Rx(臨床試驗標識符NCT01041222)，進行第一階段的研究以評估安全性。

6 內源性基因治療

目前外源性基因治療無論從靶向、途徑和方法都未獲得滿意的療效，且具有嚴重的副作用和安全性風險。多數研究結果表明許多外源性基因治療是沒有可行性的。近來動物研究〔35～38〕發現成年哺乳動物腦和脊髓存在神經前體細胞，在ALS等病理調節下，可以活化、增生和定向遷移到疾病受累解剖區，發揮神經修復功能，但其修復能力有限，不能有效地改善神經功能缺損。但這些研究結果為啟動內源性神經前體細胞的基因治療帶來了新的希望。如果能找到調控內源性神經前體細胞活化、增生和定向遷移基因治療方法或途徑，必將為治療或延緩ALS帶來新的希望，也克服了外源性基因治療的許多缺陷。

綜上，基因治療是目前為止最有前景的靶向治療之一，它能從根本上治愈一些現有的常規療法所不能治愈的疾病，尤其是某些遺傳性疾病，同時其臨床應用的倫理學和安全性仍存在爭議。對于ALS在現階段可行的基因治療方法僅僅局限于保護運動神經元細胞或延緩其變性。

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