尖嘴林檎葉的化學成分

盧 靜， 楊豐慶， 夏之寧

(重慶大學 化學化工學院，重慶400044)

林檎，屬于薔薇科蘋果屬植物。據《中國植物志》［1］的分類，目前我國分布的有尖嘴林檎Malus melliana (Hana-Mazz)Rehd 和臺灣林檎Malus formosana (Kawak，Kooidz)Kawak，主要分布于我國江西、湖南、福建、廣西、云南、貴州及臺灣等地區。廣西所謂的“大果山楂”、“廣山楂”、湖南江華俗稱的“冬梨子”和蘭山俗稱的“花紅”均屬臺灣林檎［2］。

林檎葉中含有許多有益人體健康的營養成分(蛋氨酸，蘇氨酸，維生素C 及維生素E 等)［3］，以及黃酮類、甾醇類、萜類、皂苷和有機酸等多種化學成分［4］，具有防癌、降壓、抗氧化、保肝［5］、提高免疫［6］等多種功效，并對一些細菌、霉菌和酵母有抑制作用［7］。在我國廣西、湖南等省(區)地區和少數民族地區群眾有利用林檎葉作茶飲的習慣，從1988 年起，就已有多個科研項目對其進行過研究，并加工制作了林檎保健茶、東力神保健茶和林檎保健茶系列飲料產品［8］，但產品仍未得到廣泛的推廣和利用。我國林檎葉資源廣闊，價格低，但利用率不高。目前國內對林檎葉進行的相關研究也主要集中在開發其保健功能方面，對其植物化學方面的研究較少，不清楚其主要化學成分，且不明確發揮活性作用的化學物質，未能得到很好的推廣和應用。

本課題組已經通過過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARS)模型測定了林檎葉石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提醇沉及水提物去多糖這5 個粗提物部位的PPARS 活性，實驗結果表明林檎葉乙酸乙酯部位的PPARβ 與PPARγ 活性約為陽性藥0.9倍，有較好的抗糖尿病作用。另外，本課題組還利用AB-8 大孔吸附樹脂富集純化林檎葉總黃酮，結合DPPH 自由基清除法和鐵離子還原能力法測定了總黃酮的抗氧化能力，實驗結果表明林檎葉總黃酮與維生素c 相比有明顯的抗氧化活性。因此為尋找林檎葉的活性成分，本實驗對廣西柳州市售的尖嘴林檎干燥葉進行了化學成分的研究，從乙酸乙酯部位分離得到9 個化合物，其中有2 個甾醇類化合物，3 個五環三萜類化合物和4 個黃酮類化合物。9 個化合物均為首次從該植物中分離得到，并根據實際分離得到的單體化合物的量計算(化合物的質量/干燥葉的質量)，推測根皮苷(約5.3‰)與三葉苷 (約3.3‰)為尖嘴林檎葉的主要化學成分。

1 儀器和材料

X-4 型顯微熔點儀(上海精密科學儀器有限公司);川儀LC-900B 型高效液相色譜儀;薄層硅膠(GF254，青島海洋化工有限公司);Sephadex LH-20 凝膠(德國merk);柱色譜用硅膠均購至青島裕民源硅膠試劑廠;Bruker Avance 500 型核磁共振(1H-NMR 和13C-NMR)譜儀，TMS 為內標;試劑均為分析純。

尖嘴林檎干燥葉于2010 年10 月購于廣西柳州市融水縣市場，經重慶市中藥研究院生藥室秦松云副研究員鑒定為尖嘴林檎Malus melliana (Hana-Mazz)Rehd. 的干燥葉。

2 提取與分離

剪碎的干燥林檎葉750 g，石油醚60 ℃回流提取3 次(每次1 h)，料液比1 ∶8。殘渣用70%乙醇水溶液80 ℃回流提取3 次(每次1 h)。合并提取液，減壓濃縮得浸膏200 g，浸膏再用乙酸乙酯萃取4 次。各部分經減壓濃縮，得石油醚部分10.0 g，乙酸乙酯部分150.0 g。取乙酸乙酯部分浸膏140.0 g，經硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，按照TLC 特征合并相似成分，共得12 個餾分(Fr.1-Fr.12)。Fr.3 靜置一段時間后析出白色針狀結晶，多次結晶得化合物1(50 mg)，剩余部分經過重復硅膠柱分離得到化合物2 (15 mg);Fr.4 經熱甲醇溶解后，分為可溶部分和沉淀部分，再分別對這兩部分進行硅膠柱分離及用95%乙醇反復結晶得到化合物3 (70 mg)和4 (200 mg)，化合物3、4 為同分異構體;Fr.6 經重復硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯洗脫(7 ∶3)，得到化合物5 (20 mg);Fr.7 經硅膠柱色譜分離后得到Fr.7 (A-E)5 個部分，其中Fr.7D經Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫得化合物6 (30 mg);Fr.9 采用硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯 (1 ∶1)到100%乙酸乙酯梯度洗脫，得6 個餾分Fr.9 (AF)，Fr.9B 經重復硅膠柱色譜分離得化合物7 (約4.0 g)，Fr.9E 經重復硅膠柱色譜分離得化合物8(約2.5 g)，化合物7、8 為同分異構體;Fr.10 經多次Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫得化合物9 (25 mg)。

3 結構鑒定

化合物1:白色粉末，mp 139 ～141 ℃。13CNMR (125 Hz，CDCl3)δ:37.4 (C-1)，26.2 (C-2)，72.0 (C-3)，42.4 (C-4)，140.9 (C-5)，121.9(C-6)，33.9 (C-7)，31.8 (C-8)，50.3 (C-9)，36.7 (C-10)，21.3 (C-11)，40.0 (C-12)，42.5(C-13)，56.9 (C-14)，24.5 (C-15)，29.3 (C-16)，56.2 (C-17)，19.2 (C-18)，12.0 (C-19)，36.3 (C-20)，18.4 (C-21)，32.1 (C-22)，28.4(C-23)，46.0 (C-24)，29.3 (C-25)，12.2 (C-26)，19.6 (C-27)，23.2 (C-28)，19.0 (C-29)。以上數據與文獻［9］報道的基本一致，故確定化合物1 為β-谷甾醇.

化合物2:白色粉末，mp 276 ～278 ℃。1HNMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.32 (1H，s，H-6)為烯氫質子，4.21 (1H，d，J=7.5 Hz，H-1')為糖上端基質子，3.11 (1H，q，J = 4.7 Hz，H-4')，3.04 (2H，q，J =5.0 Hz，H-3'，2')，2.88 (1H，m，H-5')分別為葡萄糖環上質子，3.42 (1H，dd，J=5.2，10.8 Hz，H-6')，3.41 (2H，m，H-6')為葡萄糖C-6'上質子信號，3.63 (1H，m，H-3α);0.64，0.95 分別為兩個甲基單峰。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:36.8 (C-1)，29.3 (C-2)，76.9(C-3，C-5')，41.8 (C-4，C-13)，140.4 (C-5)，121.2 (C-6)，31.4 (C-7，8)，49.6 (C-9)，36.2(C-10)，20.6 (C-11)，38.3 (C-12)，56.2 (C-14)，23.9 (C-15)，27.8 (C-16)，55.4 (C-17)，11.7 (C-18)，19.1 (C-19)，35.5 (C-20)，18.6(C-21)，33.3 (C-22)，25.4 (C-23)，45.1 (C-24)，28.7 (C-25)，19.7 (C-26)，18.9 (C-27)，22.6 (C-28)，11.8 (C-29)，100.8 (C-1')，73.4(C-2')，76.7 (C-3')，70.0 (C-4')，76.9 (C-5')，61.0 (C-6')。以上數據與文獻［10-11］報道的基本一致，故確定化合物2 為胡蘿卜苷。

化合物3:白色粉末，mp 308 ～310 ℃，香草醛-濃硫酸顯紅色。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.12 (1H，br s，H-12)為一個三取代烯鍵信號，2.99 (1H，t，J =4.5 Hz，H-3)，2.10 (1H，d，J=11.5 Hz，H-18)，1.03 (3H，s，H-27)，0.91 (3H，d，J=7.5 Hz，H-30)，0.89 (3H，s，H-23)，0.86(3H，s，H-25)，0.81 (3H，d，J=6.5 Hz，H-29)，0.74 (3H，s，H-26)，0.67 (3H，s，H-24)為7 個甲基氫信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:38.4(C-1)，27.0 (C-2)，76.8 (C-3)，38.5 (C-4，-8)，54.8 (C-5)，17.0 (C-6)，36.3 (C-7)，52.4 (C-9)，38.3 (C-10)，18.0 (C-11)，124.6 (C-12)，138.2 (C-13)，41.6 (C-14)，27.6 (C-15)，21.1(C-16)，47.0 (C-17)，39.1 (C-18)，46.8 (C-19)，36.5 (C-21)，30.2 (C-22)，28.3 (C-23)，16.1 (C-24)，15.2 (C-25)，16.9 (C-26)，23.8(C-27)，178.3 (C-28)，32.7 (C-29)，23.3 (C-30)。以上數據與文獻［12］報道的基本一致，故確定化合物3 為齊墩果酸。

化合物4:白色粉末，mp 287 ～288 ℃，香草醛-濃硫酸顯紅色。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.12 (1H，br s，H-12)為一個三取代烯鍵信號，2.99 (1H，t，J=4.5 Hz，H-3)，2.10 (1H，d，J=11.5 Hz，H-18)，1.03 (3H，s，H-27)，0.91 (3H，d，J=7.5 Hz，H-30)，0.89 (3H，s，H-23)，0.86(3H，s，H-25)，0.80 (3H，d，J=6.5 Hz，H-29)，0.74 (3H，s，H-26)，0.67 (3H，s，H-24)為7 個甲基氫信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:38.3(C-1 )，27.0 (C-2)，76.9 (C-3)，38.4 (C-4)，54.8 (C-5)，18.0 (C-6)，30.2 (C-7 )，39.1 (C-8)，47.0 (C-9)，36.6 (C-10)，23.8 (C-11)，124.6 (C-12)，138.2 (C-13)，41.6 (C-14)，32.7(C-15)，22.9 (C-16)，46.8 (C-17)，52.4 (C-18)，38.5 (C-19)，39.0 (C-20)，27.6 (C-21)，36.3 (C-22)，28.3 (C-23)，16.9 (C-24)，16.1(C-25)，15.2 (C-26)，23.3 (C-27)，178.3 (C-28)，17.0 (C-29)，21.1 (C-30)。以上數據與文獻［13］報道的基本一致，故確定化合物4 為熊果酸。

化合物5:白色粉末(CH2Cl2-MeOH)，mp 175～176 ℃，香草醛-濃硫酸顯紅色。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.23 (1H，br s，H-12)為一個三取代烯鍵信號，3.12 (1H，t，J =4.5 Hz，H-3)，2.17 ～2.23 (1H，m，H-18)，0.67 (3H，s，H-24)，0.71 (3H，s，H-26)，0.88 (3H，s，H-25)，0.90(3H，s，H-23)，0.92 (3H，d，J =7.5 Hz，H-30)，1.24 (3H，s，H-27)，0.84 (3H，d，J =12.0 Hz，H-29)為7 個甲基氫信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:44.7 (C-1)，67.1 (C-2)，82.2 (C-3)，37.8 (C-4)，54.9 (C-5)，18.2 (C-6)，32.4 (C-7)，41.2 (C-8)，47.3 (C-9)，37.8 (C-10)，23.2(C-11)，122.2 (C-12)，143.5 (C-13)，41.2 (C-14)，28.4 (C-15)，23.2 (C-16)，46.7 (C-17)，43.2 (C-18)，80.1 (C-19)，34.9 (C-20)，28.8(C-21)，32.3 (C-22)，24.4 (C-23)，24.1 (C-24)，16.2 (C-25)，17.0 (C-26)，27.2 (C-27)，179.2 (C-28)，24.5 (C-29)，24.1 (C-30)。以上數據與文獻［14］報道的基本一致，故確定化合物5 為阿江酸。

化合物6:淡黃色棱柱行結晶(甲醇)，mp 285 ～286 ℃。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:8.06(2H，d，J = 7.5 Hz，H-2'，H-6' )，7.55 ～7.62(3H，m，H-3'，H-4'，H-5')，6.96 (1H，s，H-3)，6.52 (1H，s，H-8)，6.22 (1H，s，H-6)。13C-NMR(125 Hz，DMSO-d6)δ:163.2 (C-1)，105.2 (C-3)，181.9 (C-4)，161.5 (C-5)，99.0 (C-6)，164.5 (C-7)，94.1 (C-8)，157.5 (C-9)，104.0(C-10)，130.7 (C-1 )，126.4 (C-2 ，C-6 )，129.2(C-3 ，C-5 )，132.0 (C-4 )。以上數據與文獻［15］報道的基本一致，故確定化合物6 為白楊素。

化合物7:淡黃色針狀結晶，mp 113 ～114 ℃。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:2.80 (2H，t，J =7.5Hz，H-β)，3.19-3.74 (8H，m，glucose H and H-α)，4.95 (1H，d，J = 7.5 Hz，anomeric H)，4.62 (1H，t，J =6.0 Hz，carbohydrate OH)，5.07(1H，d，J=5.5 Hz，carbohydrate OH)，5.17 (1H，d，J = 4.0 Hz，carbohydrate OH)，5.31 (1H，d，J=5.0 Hz，carbohydrate OH)，5.95 (1H，d，J =2.0 Hz，H-5')，6.15 (1H，d，J=2.0 Hz，H-3')，6.66 (2H，d，J =8.0 Hz，H-3，H-5)，7.05 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2，H-6，9.11，10.59 (2 br s，phenolic OH )，13.53 (s，6-OH)。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:131.6 (C-1)，129.3 (C-2，C-6)，115.1 (C-3，C-5)，155.3 (C-4)，45.1 (C-α)，29.1 (C-β)，105.2 (C-1')，160.9 (C-2')，96.9(C-3')，165.5 (C-4')，94.4 (C-5')，164.5 (C-6')，204.8 (CC =O)，100.9 (CG-1)，73.3 (CG-2)，76.8 (CG-3)，69.5 (CG-4)，77.3 (CG-5)，60.6 (CG-6)。以上數據與文獻［16］報道的基本一致，故確定化合物7 為根皮苷。

化合物8:白色針狀結晶，mp 168 ～169 ℃。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:6.97 (2H，d，J =8.5 Hz，H-2，H-6)，6.62 (2H，d，J =8.5 Hz，H-3，H-5 )，6.10，5.92 (2H，2s，H-3'，H-5')，4.96(1H，d，J=7 Hz，anomeric H)，3.16 ～3.73 (8H，m，glucose H and H-α)，3.92，3.94，3.95，3.96(4H，4s，carbohydrate OH)，2.74 (2H，t，J =7.0 Hz，H-β)。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:133.3(C-1)，130.5 (C-2，C-6)，155.6 (C-4)，116.6(C-3，C-5)，46.0 (C-α)，30.1 (C-β)，206.5(CC= O)，106.6 (C-1')，166.2 (C-2'，C-6')，95.5 (C-3'，C-5')，165.1 (C-4')，101.2 (CG-1)，74.1 (CG-2)，77.4 (CG-3)，70.5 (CG-4)，77.6(CG-5)，62.7 (CG-6)。以上數據與文獻［17］報道的基本一致，故確定化合物8 為三葉苷。

化合物9:黃色粉末，沒有確定的熔點，260 ℃以上變黑。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:11.23(1H，br s，5-OH);9.68 (1H，br s，7-OH)，9.30(2H，br s，2'-OH，4'-OH)，7.41 (1H，s，H-6')，7.20 (1H，d，J=7.5 Hz，H-3)，6.82 (1H，d，J=8.0 Hz，H-3')，6.51 (1H，s，H-8)，6.39 (1H，s，H-6)，4.63 (1H，s，H-1″)，3.16 ～3.67 之間的多重峰為葡萄糖上的質子信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:167.4 (C-2)，116.1 (C-3)，178.8(C-4)，157.0 (C-5)，97.6 (C-6)，167.5 (C-7)，92.4 (C-8)，147.8 (C-9)，103.7 (C-10)，117.8(C-1')，145.6 (C-2')，110.8 (C-3')，145.7 (C-4')，124.4 (C-5')，123.5 (C-6')，99.7 (CG-1)，73.0 (CG-2)，76.6 (CG-3)，69.4 (CG-4)，77.2(CG-5)，60.5 (CG-6)。以上數據與文獻［18］報道的基本一致，故確定化合物9 為isoetin 5'-glucoside.

［1］ 中國科學院植物研究所數字植物項目組. 中國植物志:36卷［M］. 北京:科學出版社，1974:400-402.

［2］ 鄧毓芳，劉顯旋，鐘海雁，等. 林檎生物學特性及開發利用前景的研究［J］. 中南林學院學報，1996，16(4):24-27.

［3］ 曾曉雄，譚淑宜，羅澤民. 林檎葉保健茶主要化學成分分析［J］. 湖南農學院學報，1993，19(5):474-476.

［4］ 陳 勇，甄 漢，陸雪梅. 廣山楂主要化學成分的定量研究［J］. 中藥研究與信息. 2000，2(11):18-19，21.

［5］ 潘 瑩，張林麗. 大果山楂黃酮提取物對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的保護作用［J］. 時珍國醫國藥，2008，19(2):318-319.

［6］ 李忠海，鐘海雁，魏元青，等. 林檎葉提取成分對小鼠免疫功能的影響［J］. 中南林學院學報，2003，23(4):28-31.

［7］ 鄧芳席，黃祖法. 林檎葉抑菌作用的研究［J］. 食品科學，1996，17(3):47-50.

［8］ 王融初，尚本清，黃祖法，等. 林檎葉的綜合利用研究［J］.湖南農學院學報. 1994，20(4):345-350.

［9］ 徐潤生，袁 珂，殷明文，等. 羽芒菊化學成分研究［J］.中草藥，2009，40(7):1015-1018.

［10］ 李文武，丁立生，李伯剛. 苧麻根化學成分的初步研究［J］. 中國中藥雜志，1996，21(7):427-428.

［11］ 陳國慶，劉艷麗，謝 茜，等. 苧麻根化學成分研究［J］.中草藥，2009，40(5):683-686.

［12］ Werner S，Nebojsa S，Weis R，et al. Complete assignments of1H and13C-NMR resonances of oleanolic acid，18a-oleanolic acid，ursolic acid and their 11-oxo derivatives［J］. Magn Reson Chem，2003，41(8):636 -638.

［13］ Silva M G，Vieira I P，Mendes F P，et al. Variation of ursolic acid content in eight Ocimum species from northeastern Brazil［J］. Molecules，2008，13(10):2482-2487.

［14］ 李延芳，胡立宏，樓鳳昌. 野薔薇根化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，2003，38(5):336-338.

［15］ Chen L J，David E G，Jonathan J. Isolation and identification of four flavonoid constituents from the seeds of Oroxylum indicum by high-speed counter-current chromatography［J］. J Chromatogr A，2003，998(1):95-105.

［16］ Dick A J，Redden P R，DeMarco A C，et al. Flavonoid glycosides of Spartan Apple Peel［J］. J Agric Food Chem，1987，35(4):529-531.

［17］ 肖坤福，廖曉峰. 多穗柯黃酮類化合物的分離及鑒定［J］.林產化學與工業，2006，23(3):85-87.

［18］ Marco J A，Barbera O，Rodriguze S，et al. Flavonoids and other phenolics from Artemzsia Hispanica［J］. Phytochemistry，1988，27(10):3155-3159.