DNA甲基化及測定方法

史雙林

(北華大學檢驗學院，吉林 吉林 132013)

在真核生物中，甲基化只發生在胞嘧啶第五位碳原子上，由DNA甲基化轉移酶(DNMT)催化，以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，將甲基轉移到胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)的一種反應。其可保護DNA不被限制性內切酶切開。在人類基因組中，DNA的胞嘧啶約有4％被甲基化，它與基因表達有重要關系。活性染色質DNA呈低甲基化。60％～90％ CpG二核苷酸的胞嘧啶是甲基化的，主要散布在DNA重復序列。管家基因和組織特異性基因的5′端，啟動子和第一個外顯子區，由CpG密集(C+G>50％)而成，長度為1 000～2 000 bp，稱為CpG島，通常是非甲基化的，其甲基化可抑制轉錄，基因靜默。DNA甲基化與研究在非DNA序列改變的修飾，影響基因表達的可遺傳的表觀遺傳學密切相關。其與組蛋白乙酰化在基因表達調控中的作用，與腫瘤、衰老、分化等一系列醫學生物學問題有關〔1～4〕。

1 DNA甲基化

1.1DNA甲基化譜的建立 DNA甲基化分為2種：維持甲基化和從頭甲基化。維持甲基化是當甲基化的雙鏈DNA復制后，在DNMT1作用下，生成的兩條新鏈中，只有親代鏈是甲基化，而新合成的子代鏈是非甲基化的。DNA整體甲基化主要與DNMT1相關，對生物DNA甲基化表型起維持作用。從頭甲基化則是在完全去甲基化的位點引入甲基，在從頭甲基化酶DNMT3a和DNMT3b催化下，建立甲基化機制。在早期胚胎和胚胎期腫瘤(EC)的細胞中，DNMT1完全失活，基因組完全去甲基化，此后DNMT3a和DNMT3b催化下，基因組開始重建甲基化譜。其建立過程就是細胞分化的完成過程，也是細胞部分或完全喪失分裂能力的過程。具有組織特異性，甲基化譜不同的細胞其功能也不同〔1〕。

1.2DNA甲基化可改變DNA構象，影響蛋白質與DNA的結合 DNA甲基化后由于甲基在DNA雙螺旋深溝中暴露在外，改變了DNA的構象，影響其與蛋白質分子的相互作用，呈空間位阻效應。DNA通常以B型狀態存在，右手螺旋。當高度甲基化時，以Z型狀態存在，左手螺旋，比B型較為細長。Z-DNA的抗原性較強，可以免疫家兔制備抗體。利用Z-DNA抗體即可檢測Z-DNA的存在〔2，3〕。

基因啟動子部位甲基化使甲基-CpG結合蛋白(MeCPs)附著，從而直接妨礙啟動子與轉錄因子(Sp1，E2F)，核因子(NF)-κB等結合，抑制轉錄。1989年在細胞核提取物中發現了與DNA甲基化有特異親和力的蛋白質MeCP1，它可以識別至少12個或更多對稱性的CpG位點形成復合體。為一個大的多亞單位復合物，其中結合結構域(MBD)2結構域介導了復合物與DNA甲基化的識別。隨后發現了結合單一CpG位點的MeCP2，有特異性，比MeCP1豐度高。MeCP2有兩個重要結構域：一是甲基化CpG MBD，與啟動子甲基化CpG結合；另一個是轉錄抑制結構域(TRD)，可招集轉錄抑制子(Sin3)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)，形成轉錄抑制復合物，抑制轉錄〔3～5〕。

組蛋白乙酰化發生在核小體八聚體組蛋白N末端，即堿性氨基酸殘基集中區，使賴氨酸殘基ε-NH2帶上正電荷，組蛋白和DNA之間的靜電引力減弱，降低親和力，有利染色質重塑和轉錄起始。組蛋白共價修飾(乙酰化、 甲基化、磷酸化等)、DNA甲基化、轉基因等機制在不同的基因調控中，彼此之間相互影響，形成“串話”，并按照一定的順序發揮作用〔6，7〕。

在DNA甲基化研究了60多年后，進入本世紀才確定了其在人類疾病的重要作用。Rett綜合征(RS)是一種嚴重影響兒童精神運動發育的疾病，(1～2.2)萬女嬰中散發1例。MeCP2基因突變是RS致病的分子基礎，MeCP2基因位于人類染色體(Xq28)，轉錄翻譯生成MeCP2蛋白，此蛋白通過調控腦源性神經營養因子(BDNF)的表達而影響神經元可塑性，進而引起腦發育障礙、記憶、認識、運動功能落后。BDNF基因有4個啟動子，在其表達前后MeCP2結合在BDNF啟動子Ⅲ上游-150的甲基化位點抑制啟動子Ⅲ，如果MeCP2蛋白突變則BDNF基因表達受到抑制〔8，9〕。

1.3DNA甲基化與基因印記、X-染色體失活、脆性X染色體綜合征密切相關 哺乳動物，子代基因分別來自父、母的2個等位基因，活性不同。胰島素樣生長因子(Igf)2來自父本的等位基因表達良好，來自母本的等位基因無活性，不表達。這種現象稱為基因印記。Igf2基因為母源印記，父源表達。因為在父源遺傳中，鼠7號染色體Igf2基因下游的印跡控制區(ICR)蛋白結合位點被甲基化不能結合特異蛋白(CTCF)，失去阻礙作用，使下游的增強子可越過ICR直接激活遠端的Igf2基因。也可相反，例如H19基因是父源印記，母源表達〔10，11〕。

X染色體很大，含有全部DNA的6％，Y染色體通常很小。盡管男性僅有一條X染色體，但是編碼的基因產物如紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)活性平均量與有兩條X染色體的女性相同。但在此酶缺欠的個體中，男性患者多于女性。因此，肯定存在某種劑量補償機制。正常雌性哺乳動物體細胞中，2條X染色體中有1條上的大多數基因在遺傳表達上是失活的。X失活發生在胚胎早期，是隨機的(可來自父本或母本)。X失活是廣泛的，X染色體上1/3的基因可能逃避。多數體細胞X失活是永久的，但在生殖細胞發育中，必須是可逆轉的。其機制涉及染色質結構的改變，包括DNA差異性甲基化和組蛋白乙酰化。在失活X染色體上，沉默基因5′上游區域內的CpG島高度甲基化，而染色體上的同源序列則是非甲基化的〔12〕。

脆性X染色體綜合征患者染色體上發現有1個葉酸敏感位點。(FMR)1基因，即脆性X染色體智力低下基因，位于Xq27.3，長38 kb，包含17個外顯子，可能編碼一種RNA結合蛋白。在非翻譯的第1外顯子內發現了1個CGG三核苷酸的重復序列，正常情況下其長度為6～50個重復次數，平均為30。在此癥受累患者中，這種CGG重復極度擴展至幾百甚至幾千。當重復次數超過大約230時，FMR1基因5′端高度甲基化，轉錄關閉。FMR1 mRNA和蛋白質的缺乏被認為是造成這種綜合征臨床表現的原因。

1.4DNA甲基化與衰老的關系 基因組總體低甲基化，局部高甲基化是衰老時DNA甲基化的典型表現。這與DNA甲基化酶總活性降低有關。衰老可影響DNA甲基化，DNA甲基化也可影響衰老。某些基因啟動子的CpG島甲基化增高。測定體外培養的人二倍體成纖維細胞，小鼠細胞中DNA的5mC的含量，結果均表明其甲基化程度隨細胞代數的增高而降低，而且細胞5mC丟失的速率與其壽限(可傳代齡)密切相關〔2〕。

衰老時DNA甲基化變化具有不均一性。檢測不同代齡人成纖維細胞DNA的衛星(Sat)2和Sat 3的甲基化狀態，結果表明：Chr1、Chr 9和Chr 16的近著絲粒異染色質富含Sat2和Sat3。Sat3的DNA甲基化降低速度比Sat2和總體DNA快2倍。他們認為這種降低可增加染色體重排的可能性，這種染色體不穩定性是復制性衰老的原因之一〔2〕。

DNMT1抑制劑5-雜氮-2脫氧胞苷酸和5-雜氮胞苷酸，為胞嘧啶衍生物，可降低DNA甲基化水平，促進衰老。

1.5DNA甲基化與腫瘤的關系 腫瘤細胞中常有DNA整體甲基化水平下降，主要是重復序列的去甲基化，導致整個基因組不穩定及特定序列高甲基化并存的現象，這與異常的DNMT有關。一些癌基因通過去甲基化而被激活；一些抑癌基因啟動子CpG島高甲基化使其失活，誘發癌癥。高度、中度重復DNA序列低甲基化，包括異染色質的衛星DNA LINE-1，人內源性逆轉錄病毒(HERV)-K家族，NBL1等。在慢性淋巴細胞白血病、膀胱癌、肝癌等均觀察到LINE-1低甲基化。LINE-1為高度重復序列，散布的反轉錄轉座子，人類基因約15％由其構成，長度6 kb以上，大約40萬拷貝，可將遺傳信息準確地插入某些特定位置，以DNA-RNA-DNA方式轉座。甚至拷貝數高于LINE-1的Alu序列也低甲基化，其占人類基因組大于10％，長度約0.3 kb，大于100萬拷貝，它也能移動，偶爾引導癌癥相關基因插入。在乳腺癌，卵巢上皮細胞癌，Wilms腫瘤中，Chr1著絲粒主要DNA構件Satα及在近著絲粒區，BstBI位點低甲基化，Chr1 Sat2和Chr16 Sat2 低甲基化。肝細胞癌中，Chr9長的近著絲粒區主要構件Sat2和Sat3均低甲基化〔13〕。

DNMT3b基因突變會引發罕見的常染色體隱性遺傳(ICF)綜合征。由于DNMT3B基因失活，阻斷了從頭甲基化，使重著絲粒異染色質的主要構件典型的Sat2和Sat3 低甲基化，引起一種罕見的精神，面部失常癥狀〔1，8，13〕。

最新的一項研究顯示，由幽門桿菌(PY)感染引發的胃癌，在不同靶細胞Alu和Satα低甲基化；LINE-1僅在原發性胃癌低甲基化，人胃癌不總是基因組低甲基化〔14〕。

近些年研究成果闡明了為何三苯氧胺(tamoxifen)治療乳腺癌的同時導致子宮內膜癌這一長期倍受公眾和科學界關注的重要問題。Tamoxifen不僅影響雌激素相關靶基因的表達，而且調控一些獨特的基因，PAX2基因在介導雌激素(E2)和Tamoxifen刺激的子宮內膜細胞增殖和癌變過程中起著關鍵作用。在癌變的細胞中，PAX2基因啟動子低甲基化，E2激活E2受體(ER)與Sp1、共激活子形成轉錄復合體，促進基因表達。而在正常子宮內膜上皮細胞中，PAX2基因高甲基化特異性結合MeCP2與SIN3A、HDAC共同形成轉錄抑制復合物，ER不能被E2激活，抑制轉錄。這一發現為子宮內膜癌的治療和預防提供了新的思路和藥物靶點〔15，16〕。

在腫瘤的起始及進展過程中，DNA甲基化和組蛋白去乙酰化是改變表觀遺傳創建新治療方法的重要靶點。與基因改變的不可逆性相比，腫瘤表觀遺傳學改變是可逆的。5-雜氮胞苷酸和5-雜氮2脫氧胞苷酸是研究最廣泛的DNMT抑制劑。作為核苷酸類似物在DNA復制時，摻入到自然胞嘧啶堿基位置，這僅發生在S期。一旦摻入到DNA上，復合體會形成DNMT的活性位點，共價結合捕獲DNMT，降低酶的活性，在幾次細胞分裂后，DNA去甲基化，沉默的抑癌基因重新活化。5-雜氮胞苷酸也可以摻入到RNA，干擾蛋白質的翻譯，對酶的抑制更加有效。它們也可作為血管生成抑制劑，抑制腫瘤上皮細胞和血管生成。(Zebularine)是新的DNMT抑制劑，非常穩定，適合口服，毒性小，對腫瘤細胞有高選擇性。Procainamide、Epigallocathechin-3-gallate、MG98等也具有類似作用〔17〕。

2 DNA甲基化檢測方法

2.1亞硫酸氫鈉法 亞硫酸氫鈉法的基本原理是：亞硫酸氫鈉可以通過磺酸基作用使胞嘧啶脫氨基轉化為尿嘧啶，后者經PCR擴增變成胸腺嘧啶T，形成T：A的配對。但甲基化的胞嘧啶并未改變。甲基化狀態不同的DNA片段就轉化為有堿基序列差異的兩個片段。這種差異可以用DNA測序，或者聯合限制性內切酶分析法，或者是進行不同引物的PCR擴增等方法來把它們顯示。

2.1.1亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法〔18〕

2.1.2亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法(COBRA) 樣本經亞硫酸氫鈉處理后，某些堿基序列的改變可以產生新的限制性內切酶圖譜。為調查類固醇17-α-羥化酶CYP17A2基因-2544～-1522的甲基化狀態，處理基因組后，PCR產物產生新的限制性內切酶位點，Fokl識別GGATG，EcorⅠ識別GAATTC，Acil識別CCGC，Dral識別TTTAAA。酶切PCR產物，以鑒別。這種方法工作量和耗費相對較小，快速，但只能獲得特殊酶切位點甲基化的信息〔19〕。

2.1.3甲基化特異性PCR(MS-PCR) 目的片段經處理后，設計甲基化和非甲基化兩種引物，樣本DNA根據自身的甲基化狀態在相應的PCR組中得到擴增，甲基化引物含有3個CG，靠近3＇端，結果凝膠電泳圖像顯示出來。此方法對測定多種腫瘤抑癌基因(p16，p15，E-cadherin等)具重要性。為增加MS-PCR 的靈敏度，采用巢式PCR，設計兩對引物，一對引物對應的序列在模板的外側，為外引物(M2，U2)，另一對互補序列在同一模板的外引物的內側，為內引物(M，U)。此法特異性高，工作簡單，耗費和耗時都較小〔20〕。

2.1.4甲基化敏感的單核苷酸擴增法(Ms-SNuPE) 可快速判斷DNA片段中某些具體位點的甲基化狀況，定量分析。DNA樣本經處理，PCR擴增，凝膠電泳分離目的片段。在p16基因5＇端CpG島選擇3個轉錄起始位點，分別設計引物，使引物的3＇端緊鄰被檢測的堿基上。然后把該引物、Taq酶、PCR產物和32P標記的dCTP作為PCR體系混合擴增。如果該位點發生了甲基化，放射性的dCTP將進入合成的序列，產物經電泳分離，放射性成像即可顯示。而如果沒有甲基化，該位點經處理轉變為T，32P-dCTP無法進入，條帶為陰性。再檢測另一組非甲基化，將32P-TTP摻入，又可得到陽性條帶。測定C：T信號比值。通過放射性強度來定量分析，并能檢測不對稱甲基化。但不能對較長序列進行全面的考察，多位點檢測需要設計較多的引物。用到放射性物質也是其缺陷之一〔21〕。

2.2甲基化敏感的限制性內切酶法 一些限制性內切酶含有CpG雙核苷酸序列識別位點，它們往往只識別甲基化的序列，而對非甲基化沒有活性，這類酶中比較重要的BstUⅠ、NotⅠ和SmaⅠ。以此設計許多方法。

2.2.1甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF) 將目的片段或基因組分為兩份，兩者均用MseⅠ(甲基化不敏感的酶，識別TTAA)處理，將大片段切割成適當大小片段，并且其中一份加入BstUⅠ(甲基化敏感的酶，識別CGCG)，設計引物為10個核苷酸，其3＇端為CGCG，進行PCR擴增，最后把兩份樣本電泳分離，對照。在MseⅠ組和MseⅠ/ BstUⅠ組中同時出現的條帶就是甲基化位點出現的部位。若進行基因組DNA檢測，還應進一步作Southern雜交以分離和確認〔22〕。

2.2.2限制性標志物全基因組掃描(RLGS) 可同時分析2 000個以上片段的甲基化情況，基因組DNA以Landmark酶消化，此酶為關鍵酶，常用甲基敏感的NotⅠ(GC↓GGCCGC)或AscⅠ(GG↓CGCGCC)，切割頻率低且識別序列至少含2個CpG位點。切割后放射性標記末端。再以EcoRⅤ(甲基不敏感，切割頻率較NotⅠ高)消化產生較短的NotⅠ-EcoRⅤ片段，電泳展開。然后，用HinfⅠ(甲基不敏感，切割頻率較EcoRⅤ高)在凝膠內消化，產生更短的片段。將凝膠旋轉90°第2次電泳，顯影成RLGS圖譜。兩個樣本比較，樣本中缺失的斑點為甲基化位點。計算機可快速識別缺失斑點，對基因組甲基化狀態進行整體分析。集中考察非甲基化區域，避免了重復序列的干擾。需要大量的DNA，技術復雜〔23，24〕。

2.2.3差異性甲基化雜交分析(DMH) 腫瘤基因組DNA經MseⅠ TTAA消化為100～200 bp的小片段，其識別序列很少位于CG豐富區，保持了CpG島的完整性，以用于構建CpG島文庫。正常基因組DNA也同樣處理，富含CG片段的末端連上接頭。消除重復序列。再以BstUⅠ CGCG消化。將MseⅠ和MseⅠ/BstUⅠ處理后片段分別進行PCR，得到MseⅠ和MseⅠ/BstUⅠ處理的擴增子。將其作為掃描高甲基化序列的探針。點樣膜上制成高密度的CpG島文庫微陣列。將正常標本及乳腺癌ZR-75-1、Hs578t(A，B，C)32P標記的MseⅠ處理的擴增子在3個膜上進行雜交，以32P標記的MseⅠ/BstUⅠ處理的擴增子在另外3個膜上進行雜交(A＇，B＇，C＇)。成像可得到甲基化信息。應用高密度DNA陣列雜交，大通量，易自動化。但會造成假陽性結果。可克隆，測序或Southern雜交進一步證實〔25〕。

2.2.4甲基化CpG島擴增子分析(MCA) 通過擴增2個相鄰(<1 kb )SmaⅠ位點(CCCGGG)來富集甲基化的CpG島。甲基化敏感的SmaⅠ識別CCCGGG序列，但并不切割甲基化位點，產生平端，隨后以甲基化不敏感的SmaⅠ的同裂酶XmaⅠ消化，產生CCGG黏端，再連上接頭，PCR擴增，得到MCA的擴增子。在尼龍膜上點樣，以任何感興趣探針進行斑點雜交，可半定量，腫瘤標本可檢測到異常的甲基化擴增子。技術復雜，易受重復序列干擾〔26〕。

2.3化學測序法為基礎的甲基化分析

2.4單核苷酸鑒定法

2.4.1相鄰鄰居法

2.4.2逆相高壓液相層析(RP-HPLC) 5類核苷酸在極性溶液中的溶解度不同，在經過非極性的過濾柱時，溶解度高的dCMP隨極性溶液先流出，而溶解度低的dAMP則在柱中停留時間長，后流出。它們出柱的順序是dCMP、5mdCMP、dTMP、dGMP、dAMP。通常先用DNaseⅠ水解DNA片段，并裝好非極性的硅膠柱(它使非極性的碳氫化合物化學結合到硅膠表面)。水解產生的單核苷酸溶液注入柱內，將流出的液體用紫外線吸光監測儀進行檢測，記錄結果輸入電腦繪成吸光度-時間表。根據波峰的早晚及高度，測定出5類核苷酸的相對含量。可更準確分析基因組中甲基化的含量。需專門設備，DNA的純度要求較高，不能混入RNA〔27〕。

2.5甲基接受力檢測法〔28〕

2.6MBD柱分離甲基化CpG島〔29〕

2.7基因表達陣列法 腫瘤中，抑癌基因的失活是基因啟動子區高甲基化的結果。降低甲基化程度可以逆轉基因表達，使其上調。用DNA甲基轉移酶抑制劑(DAC)和HDAC抑制劑(TSA)處理細胞，將表達的基因片段用cDNA陣列法檢測出來，與非藥物處理組的結果相比較，就可獲知某個基因啟動子區發生甲基化情況〔30〕。

3 參考文獻

1Okano M，Bell DW，Haber DA，etal. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development〔J〕. Cell，1999；99： 247-57.

2童坦君，張宗玉. 醫學老年學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2006： 72-81.

3Valinluck V，Tsai HH，Rogstad DK，etal. Oxidative damage to methyl-CpG sequences inhibits the binding of the methyl-CpG binding domain (MBD) of methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) 〔J〕. Nucleic Acids Res，2004；32(14)：4100-8.

4Meehan RR，Lewis JD，Mckay S，etal. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA contaning methylated CpGs〔J〕. Cell，1989；58：499-507.

5Lewis JD，Meehan RR，Henzel WJ，etal. Purification，sequence，and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA〔J〕. Cell，1992；69：905-14..

6Bird A. Methylation talk between histones and DNA〔J〕. Science，2001；294：2113-5.

7Mutskov V，Felsenfeld G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9〔J〕. EMBO J，2004；23： 138-49.

8Klose R，Bird A. MeCP2 repression goes nonglobal〔J〕. Science，2003；302：793-5.

9Kriaucionis S，Bird A. DNA methylation and Rett syndrome〔J〕. Human Molecular Genetics，2003；12：R221-7.

10Felsenfeld G，Groudine M. Controling the double helix〔J〕. Nature，2003；421：448-53.

11Spilianakis CG，Flavell RA. Managing associations between different chromosomes〔J〕. Science，2006;312： 207-8.

12蓋萊哈特TD，柯林斯FS，金斯伯格D著.孫開來譯.醫學遺傳學原理〔M〕.北京：科學出版社，2001： 175-87.

13Ehrlish M. DNA methylation in cancer：too much，but also too little〔J〕. Oncogene，2002；21：5400-13.

14Yoshida T，Yamashita S，Takamura-Enya T，etal. Alu and Sat α hypomethylation in helicobacter pylori-infected gastric mucosae〔J〕. Int J Cancer，2011；128 (1)：33-9.

15Wu HJ，Chen YP，Liang J，etal. Hypomethylation-linked activation of PAX2 mediates tamoxifen-stimulated endometrial carcinogenesis〔J〕. Nature，2005；438： 981-7.

16Shang YF.Molecular mechanisms of oestrogen and SERMS in endometrial carcinogenesis〔J〕.Nature，2006;6： 360-7.

17Hellebrekers DME，Griffioen AW，van Engeland M.Dual targeting of epigenetic therapy in cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007；1775： 76-91.

18Frommer M，McDonald LE，Millar DS，etal. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89(5)：1827-31.

19Sadri R，Hornsby PJ. Rapid analysis of DNA methylation using new restriction enzyme sites created by bisulfite modification〔J〕.Nucleic Acids Res,1996;24(24)：5058-9.

20Herman JG，Graff JR，Myohannen S，etal.Methylation-specific PCR：a novel PCR assay for methylation status of CpG islands〔J〕.Proc Natl Acad USA，1996；93(18)：9821-6.

21Gonzalgo ML，Jones PA.Rapid quantitation of methylation at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE)〔J〕.Nucleic Acids Res,1997；25(12)：2529-31.

22Huang TH，Laux DE，Hamlin BC，etal.Identification of DNA methylation markers for human breast carcinomas using the methylation-sensitive restriction finger printing technique〔J〕.Cancer Res,1997;57(6)：1030-4.

23Ushijima T.Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells〔J〕.Nat Rev Genet,2005；5(3)：223-31.

24張松法，葉 楓，陳懷增，等.基因組CpG島甲基化檢測技術研究進展〔J〕.國際遺傳學雜志，2006；29(3)：201-3.

25Huang TH，Perry MR，Laux DE.Methylation profiling of CpG islands in human breast cancer cells〔J〕.Hum Mol Genet,1999；8(3)：459-70.

26Toyota M，Ho C，Ahuja N，etal.Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification〔J〕.Cancer Res,1999；59(10)：2307-12.

27武立鵬，朱衛國.DNA甲基化的生物學應用及檢測方法進展〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2004；27(7)：468-73.

28Kim YI，Giuliano A，Hatch KD，etal.Global DNA hypomethylation increases progressively in cervical dysplasia and carcinoma〔J〕.Cancer,1994；74(3)：893-9.

29Cross SH，Charlton JA，Nan X，etal.Purification of CpG islands using methylated DNA binding column〔J〕.Nat Genet，1994；6(3)：236-44.

30Suzuki H，Gabrielson E，Chen W，etal.A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorrectal cancer〔J〕.Cancer Res,1999；59(10)：2307-12.