腎素釋放機制及腎素抑制劑的研究進展*

高燕紅， 蔡珂丹， 羅 群

腎素－血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)已被發現多年，對其功能的傳統認識是維持血壓、保持體液特別是鈉鹽平衡，其對腎臟系統起重要作用［1］。近年研究證實還有許多血流動力學以外的作用。腎素的產生部位相對局限，主要由腎小球球旁器(juxtaglomerular apparatus，JGA)中的顆粒細胞所合成［1］。刺激腎素分泌的關鍵有4個方面:(1)入球小動脈壓力變化(壓力降低);(2)交感神經興奮(通過在JGA上的β1受體);(3)流經腎小管致密斑(macula densa，MD)細胞上的鈉離子濃度下降時;(4)血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)對JGA上血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)刺激的負反饋［2-5］。腎素是 RAS 中AngⅡ生成的起始也是限速步驟，從源頭腎素途徑全面阻斷RAS已成為研究的熱點。目前，在RAS研究中出現了一個新興領域，即通過內源性代謝中間產物直接局部調節腎素的合成和釋放。本文就琥珀酸/G蛋白偶聯受體91(G-protein-coupled receptor 91，GPR91)調控腎素釋放的機制及其腎素抑制劑方面的最近進展進行了綜述。

1 琥珀酸/GPR91調控腎素釋放的機制

目前，在RAS研究中出現了一個新興領域，即通過內源性代謝中間產物直接局部調節腎素的合成和釋放。研究發現GPR91在腎臟中高度表達，并且能夠被三羧酸循環中的中間產物琥珀酸所激活，最終引起球旁細胞(juxtaglomerular cell，JGC)中腎素的釋放和腎素依賴性RAS的激活［6］。

1.1 琥珀酸和GPR91 生理狀態下，琥珀酸參與線粒體中的三羧酸循環，并產生三磷酸腺苷;然而在缺氧、糖尿病和癌癥等病理狀態下，出現能量供求失衡，大量琥珀酸在線粒體、細胞質和細胞外積累［7］。在糖尿病中，琥珀酸不僅能在血漿中被檢測到，而且更易在腎小管液和尿液中檢測到［8］。在鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的糖尿病小鼠中，1周后發現其尿液中的琥珀酸濃度比血漿中的要高5～10倍［9-10］。在代謝類疾病中，推測尿液中的琥珀酸可以作為局部組織損傷的一種新型生物標志物，從而運用到醫學領域中。GPR91是孤立性的G蛋白偶聯受體，其與嘌呤 G蛋白偶聯受體 P2Y序列高度同源［11］。近來，大量研究發現GPR91并沒有在分泌腎素的JGC中表達，其主要表達在MD細胞的頂端膜上、血管內皮細胞、腎小球內皮細胞、腎小管上皮細胞和 遠 端 腎 單 位——集 合 管 (collecting duct，CD)［8，10-12］，這些定位的發現為琥珀酸/GPR91 調節腎素釋放途徑提供了有力的證據。He等［6］研究發現，GPR91能夠被三羧酸循環中的中間產物琥珀酸所激活，最終引起JGC中腎素的釋放和腎素依賴性RAS的激活。因此，琥珀酸/GPR91信號途徑被認為是糖尿病腎病、視網膜病變和心血管疾病等的病理機制。

1.2 琥珀酸/GPR91調控腎素釋放途徑 最近研究發現，高糖能夠激活腎內RAS，是腎組織損傷的一個核心因素。Peti-Peterdi［7］推測糖尿病的高糖與腎素釋放之間存在著聯系，即高糖能夠誘導三羧酸循環中的琥珀酸積聚，激活GPR91，引起JGC中腎素的釋放。1976年Baumbach等［13］首次研究發現琥珀酸影響腎素釋放;2008年Toma等［10］通過體外微灌注方法證明琥珀酸通過GPR91介導導致腎素釋放。對新鮮的JGA組織進行體外微灌注(排除全身的影響)，通過熒光共聚焦成像發現在高糖或琥珀酸灌入1～2 min后，GPR91誘導的腎素釋放明顯增加［10］。研究發現，在GPR91+/+小鼠腎臟中，腎素隨著高糖劑量依賴性地升高，而在GPR91－/－小鼠腎臟中，未見高糖誘導的腎素的釋放［10］。這些研究都說明在早期糖尿病的發病機制中，高糖通過琥珀酸/GPR91途徑介導腎素釋放，激活RAS，導致腎臟損傷。大量研究通過使用糖尿病模型，證實了琥珀酸通過GPR91介導腎素釋放、激活 RAS 和高血壓［6-8，10-11，14］。

研究發現在MD細胞中，琥珀酸/GPR91介導的細胞內信號轉導途徑與已建立的腎小管低鹽誘導腎素釋放的信號轉導途徑基本相同［15］。Vargas等［8］用琥珀酸刺激小鼠致密斑原代細胞后，發現p38和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)被激活。而在糖尿病中，GPR91介導的p-ERK1/2僅僅在MD細胞和下游腎單位中表達，并不在上游的髓袢升支粗段中表達［8］。由于p38和ERK1/2是MD細胞中環氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)激活的重要組成部分，進一步實驗發現琥珀酸同樣能介導COX-2和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的增加［8］。使用JGA微灌注，將琥珀酸灌注到入球小動脈(afferent arterioles，AA)中，發現與正常對照組相比，腎素顯著釋放;而GPR91－/－、使用MEK-1抑制劑和COX-2抑制劑的小鼠，其腎素未見明顯釋放［8］。這證明在糖尿病中腎皮質 p-p38、COX-2、PGE2和腎素平行上調，這一現象主要通過GPR91介導。在MD細胞中，病理狀態下線粒體應激，介導琥珀酸/GPR91途徑，激活p38和ERK1/2，進一步激活 COX-2，最終介導 PGE2的合成和釋放［8，16］;PGE2從 MD 細胞中胞吐后，作用于 JGC 中的 PGE2受體(E-prostanoid receptor，EP)2/4，激活JGC上的刺激型G蛋白 α(stimulatory G protein α，Gsα)偶聯受體，使細胞內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)濃度增加，激活依賴cAMP的蛋白激酶 A(protein kinase，PKA)，促使腎素分泌［4，17］。

最近研究發現GPR91除了定位于MD細胞中，還與腎小球內皮和血管的功能存在著一定的關聯性［10］。研究發現，琥珀酸激活 HEK293細胞中的GPR91后通過激活抑制型G蛋白α(inhibitory G protein α，Giα)耦聯受體通路，不僅抑制cAMP的產生，而且激活磷脂酶C-磷酸肌酸，增加細胞內Ca2+濃度［18］。在內皮細胞中，琥珀酸激活GPR91后，通過PLCβ-IP3途徑，增加細胞內Ca2+濃度，從而產生一氧化氮和 PGE2，最終作用于 JGC，介導腎素釋放［8，16］。

糖尿病腎病的發病機制主要與腎臟內RAS的激活相關聯，但是在糖尿病中，其血漿腎素水平通常是很低的，相反其血漿中的腎素原水平較高［19］。在糖尿病早期，琥珀酸/GPR91介導JGC腎素的釋放，隨后激活局部Ang II的釋放［20］;由于過度生成的Ang II，最終負反饋作用于腎素，抑制腎素的合成和釋放;但其激活CD腎素原的生成［20］。CD產生的腎素原可與腎素原受體結合，或者被酶解成活性的腎素，從而解釋了雖然JGC的腎素合成被抑制，但在糖尿病中腎臟內存在著持續的RAS的激活［20］。這個理論還在進一步的研究中，在糖尿病中血漿低腎素，但高腎素原和RAS的激活，值得我們進一步探索研究。

2 其它新興代謝分子調節腎素釋放

2.1 GPR99 由于發現琥珀酸可以與GPR91結合，引起腎素釋放［6］。這個發現打破了傳統的概念，認為一些內源性代謝分子除了傳統的作用外，還可以直接調控腎素分泌和RAS激活。α-酮戊二酸與琥珀酸密切相關，也是三羧酸循環中的中間產物，其受體是GPR99［6］。近來研究發現，GPR99可能是半胱氨酰白三烯受體3，可以與白三烯E4結合，介導血管的通透性及炎癥的產生，認為GPR99可能作為炎癥性疾病的藥物作用靶點［21］。研究發現GPR99在腎臟中廣泛表達，主要定位在遠端腎單位，推測其可能在腎素調控和腎臟水、電解質的重吸收方面有一定作用［16］。

2.2 嗅覺信號系統 Pluznick等［22］研究發現，在遠端腎單位(包括MD細胞)的頂端膜上存在著一個嗅覺信號系統。這個系統包括嗅覺受體(olfactory receptors，ORs)、腺苷酸環化酶3(adenylate cyclase 3，AC3)和嗅覺G蛋白(olfactory G protein，Golf)偶聯受體，均在腎臟表達［22］。其中AC3和 Golf都在腎小管和MD細胞上表達。在AC3－/－的小鼠MD細胞中，激活和上調COX-2和神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)，血漿中腎素的水平下降，顯示了嗅覺信號系統直接參與調控腎素的釋放［22］。在未來的研究中，我們可以進一步探討個體間ORs在調控腎素釋放中的作用。

2.3 尿酸 除了琥珀酸和嗅覺物質外，其它的代謝途徑也有可能調控腎素釋放。Kang等［23］在孤立的體外微灌注JGA小鼠中發現，尿酸通過MD細胞依賴的途徑能夠快速激活腎素釋放。

3 抑制腎素釋放的治療藥物

由于血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blockers，ARBs)和血管緊張素轉化酶抑制劑(angiotensin-converting inhibitor，ACEI)等在治療糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)中會出現腎素逃逸，引起腎臟損傷［24］。故從源頭腎素途徑全面阻斷RAS已成為研究的熱點。目前直接抑制腎素釋放主要有:阿利吉侖和腎素(原)受體抑制劑;間接抑制腎素釋放主要有:活性維生素D、優洛可定(urocortins，Ucn)、GPR91 抑制劑和 COX-2 抑制劑［25］。下面將簡單介紹間接抑制腎素釋放的藥物。

3.1 活性維生素D 近年來研究發現維生素D類似物，其生物學活性與活性維生素D非常相似，具有調控腎素釋放的作用［26-27］。Zhang 等［28］通過敲除小鼠維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)模型，給予1，25(OH)2D3進行干預，證實能抑制腎素，且減少蛋白尿，延緩腎功能衰竭進展。Li等［29］通過研究缺失VDR突變型糖尿病小鼠的生長發育，發現此類小鼠體內RAS過度激活，伴有嚴重的腎損傷，給予帕立骨化醇治療，明顯改善腎損傷。蘭凱等［30］發現帕立骨化醇可以抑制DN大鼠腎臟的腎素及AngⅡ的表達，從而減少蛋白尿，保護腎臟。為進一步研究活性維生素D如何抑制腎素釋放，我們通過STZ誘導糖尿病腎病模型，予以帕立骨化醇治療后，發現帕立骨化醇有可能通過抑制COX-2-PGE2途徑，從而抑制腎素分泌，阻斷RAS，起到保護腎臟的作用。

3.2 Ucn Ucn是一種小分子肽，是促腎上腺皮質激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)肽類家族的新成員;Ucn主要通過與相應的G蛋白偶聯的CRF受體(CRFR1和CRFR2)相結合而發揮作用［25］。Ucn能夠降低動脈血壓，增加動脈血流量，增強心肌抵抗力，起到心血管保護作用。最近研究發現在心力衰竭的羊中，Ucn聯合運用ACEI能夠顯著改善心臟功能及腎功能，降低外周阻力及心室舒張壓;應用ACEI后可能誘導血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)反饋性上調，聯合運用Ucn可以下調 PRA［31］。在最近的一項研究中，Rademaker等［32］通過對心力衰竭的羊進行試驗，發現運用Ucn能夠有效改善血流動力學、保護腎臟，這主要是通過抑制PRA和醛固酮起作用的。Li等［33］發現，用Ucn1治療STZ誘導的糖尿病大鼠能夠減少腎小球細胞外基質增厚，改善蛋白尿，抑制轉化生長因子β、結締組織生長因子和血管內皮生長因子的表達，從而保護腎臟。但這個研究中并沒有測量PRA和RAS等指標，所以還不是很清楚在糖尿病腎臟中，Ucn是否通過抑制腎素來保護腎臟。未來需要更多的實驗來證實這個理論，以便應用于臨床。

3.3 GPR91抑制劑 GPR91在糖尿病腎病的發病機制中起著重要的作用，因此在糖尿病早期有效抑制GPR91能夠起到保護腎臟的作用。過去對GPR91的研究主要是通過遺傳學方法，最近出現了一個新興藥物，即選擇性小分子hGPR91拮抗劑。研究發現琥珀酸引起大鼠的血壓升高，然而通過使用hGPR91拮抗劑可以降低其血壓［34］。GPR91抑制劑作為一個工具藥，能更有效、簡單對GPR91進行干預［35］，從而抑制 RAS，保護腎臟。然而，GPR91 抑制劑對腎素合成和分泌的影響及潛在的腎臟保護作用有待進一步研究。

3.4 COX-2抑制劑 COX包括2種亞型，COX-1和COX-2，兩者都可在腎臟中表達。其中COX-2表達在MD細胞和鄰近的髓袢升支粗段細胞中，COX-2是腎臟局部合成PGE2的主要限速酶，刺激PGE2合成后，通過 cAMP 途徑，刺激腎素釋放［17，36］。研究發現，在高腎素實驗模型中，COX-2抑制劑或COX-2－/－都能減少腎素釋放［25］。但也有研究證明，COX-2抑制劑在聯合ACEI治療糖尿病模型中，并不能降低腎素的表達，但能減少前列腺素的合成［37］。目前認為COX-2仍然是腎臟保護治療的一個靶點，至少在某種程度上其能抑制腎素釋放。

4 問題和展望

在過去的幾年里，出現了一個新興的研究領域，即中間代謝產物通過與各自的G蛋白偶聯受體結合而直接激活腎素釋放。其中最具代表性的中間代謝產物是琥珀酸，其與細胞膜受體GPR91結合后，激活腎素釋放。琥珀酸/GPR91信號途徑被認為是多數代謝性疾病的病理機制。目前有很多抑制腎素釋放的藥物，如活性維生素 D、Ucn、GPR91抑制劑和COX-2抑制劑，有待更多的臨床試驗來證實。

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