液態混菌發酵法制備高活性大豆膳食纖維研究

何曉哲，李梅青，陳健，徐敏

（安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036）

我國是大豆生產大國，每年廢棄的大豆渣雖然很多高營養價值的成分，但利用率很低[1]，特別是其中含量最高的膳食纖維。膳食纖維包括不可溶膳食纖維（IDF）和可溶性膳食纖維（SDF）。SDF 具有防止膽結石、排除體內有害金屬離子、防止糖尿病、降低血清及膽固醇、防止高血壓和心臟病等作用[2]；而IDF 則對肥胖癥、便秘、腸癌等有效[3]，膳食纖維成為調節機體功能的“第七類營養素”，是一種很有開發前景的新型功能性資源，已經成為熱門話題[4-6]。

近年來，國內外食品工作者嘗試了不同的提取和改良方法進行大豆膳食纖維的提取，主要集中在化學分離法[7]、化學試劑-酶結合分離法[8]、超聲波輔助提取[9-10]、膜分離法[11]、發酵法[12-14]等。其中，發酵法被認為是一種相對安全、高效、低成本的高品質膳食纖維制備和改良方法，但前期研究的比較少，其發酵菌種大多僅采用綠色木霉、粗壯脈紋孢菌等少數常見單一菌種，得率也僅在12%～15%。

本文以豆渣為原料，以黑曲霉和綠色木霉[15]混合菌種進行液態發酵，充分利用兩種菌種菌體生長快，周期短的優點，利用其產生的纖維素酶降解豆渣中的不可溶性膳食纖維，充分提高大豆膳食纖維的活性，為提高豆渣的高效利用及功能性改善提供一種更高效、可行的方法。

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

豆渣：安徽人人福食品公司提供；綠色木霉、黑曲霉：由合肥工業大學生物與食品工程學院微生物資源綜合利用研究室提供；MES：美國AMIESCO 公司；TRIS：上海源葉生物有限公司；乙醚，無水乙醇，濃硫酸，氫氧化鈉，丙酮等均為分析純。

1.1.2 主要儀器

VD-650 型桌上式凈化工作臺：上海三發科學儀器有限公司；LD2X-50KB 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；ZHWY-2102C 恒溫培養振蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；EYELAFDU-2100 真空冷凍干燥儀：上海愛郎儀器有限公司；FA1104A 萬分之一電子天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；DHP-916 型電熱恒溫培養箱：上海恒科技有限公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；DHG-9143BS 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.1.3 培養基

活化培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

種子培養基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，葡萄糖30 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

液體發酵培養基：脫脂大豆渣粉40 g，K2HPO42 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CMC-Na 10 g，MnSO4·H2O 0.001 5 g，ZnSO4·7H2O 0.001 5 g，氯化鈣0.3 g，氯化鈷0.002 g，蛋白胨0.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH 為中性。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵活化工藝流程

1.2.2 操作要點

預備豆渣：洗凈、烘干、粉碎，采用乙醚浸提24 h，置50 ℃的烘箱中烘干，過40 目篩，放置干燥器備用。

配制液體發酵培養基：按照1.1.3 進行液體發酵培養基的配制，取100 mL 發酵培養基至于250 mL 三角錐形瓶中，封口。

接種：挑取菌種孢子接入種子培養基，28 ℃，24 h～48 h 于恒溫培養箱中，活化后的菌種接入種子發酵液中，28 ℃，2 d～5 d 置于搖床培養箱，最后取一定培養液于發酵培養基中。

1.3 實驗設計

1.3.1 單因素實驗

分別對發酵過程中黑曲霉與綠色木霉比例、發酵時間、發酵溫度、菌種加液量以及發酵初始pH 對發酵結果的影響，根據實驗結果的顯著性，確定響應面優化因素。

1.3.2 Box-Behnken 響應面試驗設計

在單因素實驗的基礎上，采用Excel 和Design Expert.8.0.6 軟件，選取影響較大的因素，以可溶性膳食纖維得率為響應值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

在其他固定發酵條件下，考察單因素的影響效力，其結果見圖1。

圖1 不同發酵因素對可溶性膳食纖維得率的影響Fig.1 Influence of different fermentation factors on the SDF activity

實驗結果表明：前三種因素普遍對可溶性膳食纖維得率的影響均呈現先上升后下降的特點，菌種比例在2 ∶1 時可溶性膳食纖維得率最高，這可能是因為混合菌種的協和作用的調節，不同比例，協調的效果不同，只有達到最佳協調效果時所達到的降解作用才能最大；發酵時間在48 h 時為最高點，原因可能為在48小時前，菌種中的纖維素、半纖維酶對豆渣中的不可溶性膳食纖維進行講解，使不可溶性膳食纖維的糖苷鍵斷裂，生成小分子多糖，轉化為可溶性膳食纖維，之后到達一定程度，微生物生長需要作用了一部分小分子糖，呈現了下降的趨勢；而發酵溫度達到26 ℃時效果最佳，這是因為發酵的溫度對于微生物的生長的也是重要的因素之一，溫度過低，微生物生長緩慢，產酶的速度就緩慢，而溫度過高，微生物容易過早的老化，產酶的效果也迅速的降低。

因此，綜合上述內容，在菌種比例（黑曲霉：綠色木霉）為2 ∶1（圖1 中菌種比例橫坐標1、2、3、4、5 分別對應1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、2 ∶1、3 ∶1），發酵時間為48 h，發酵溫度為26 ℃的時候，各單因素的作用效力最大。其次，單因素實驗結果發現發酵pH 與發酵菌種加液量變化對可溶性膳食纖維得率的影響不明顯，根據實驗顯著性的原則，不將其納入響應面優化因素。

2.2 響應面實驗設計及結果

2.2.1 Box-Behnken 響應面試驗設計及結果

綜合單因素結果，進一步對發酵菌種比例、發酵時間以及發酵溫度進行響應面優化。實驗中因素與水平設計件表1，以此確定最優可溶性膳食纖維得率。實驗方案及結果見表2。

表1 因素水平編碼表Table 1 Experimental design of 4 factors and 3 levels in response surface method

表2 Box-Behnken 試驗設計結果Table 2 Results of data analysis by Box-Behnken design

2.2.2 響應面結果分析

通過Design-Expert.8.0.6 軟件對表2 中試驗數據進行二次多項式回歸擬合，建立二元多次回歸方程，Y=22.53+0.71A-1.09B+0.70C+1.13AB-1.65AC-1.31BC-3.40A2-3.03B2-2.34C2，對該方程的回歸分析和方差分析如表3 所示。

由表3 可知，實驗值與回歸方程預測值的決定系數R2值為98.04%，即模型響應值的變化有98.04%來自于所選變量，能較好地描述試驗結果，并且修訂系數R2adj為95.51%，P＜0.01。故該回歸模型可判定為顯著，擬合情況良好，采用響應面法針對發酵豆渣中可溶性膳食纖維得率的優化試驗設計的方法具有可行性，并且所得回歸方程模型有效、可靠。

從表3 對回歸方程系數顯著性的檢驗可知，單因素的影響順序為B＞A＞C，即發酵時間＞菌種比例＞發酵溫度。各因素中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2達到了顯著水平（P 值小于0.05）。其中，發酵時間與發酵比例、發酵時間與發酵溫度、發酵比例與發酵溫度交互作用顯著，繪制各因素交互響應面曲面圖，見圖2～圖4。

表3 回歸與方差分析結果Table 3 Regression analysis results of extraction parameter of total flavones

圖2 菌種比例（A）和發酵時間（B）對SDF 得率的等高線和響應面圖Fig.2 Contour plots s and Response surface plot for the effect of strain ration（A）and fermentation time（B）on SDF yield

圖3 菌種比例（A）和發酵溫度（C）對SDF 得率的等高線和響應面圖Fig.3 Contour plots s and Response surface plot for the effect of strain ration（A）and fermentation temperature（C）on SDF yield

由圖2，圖3，圖4 可知，等高線扁平，并且所示曲面圖陡峭，表明因素之間相互影響大。使用軟件Design-Expert.8.0.6 對2.2.1 所述二次回歸方程進行優化計算，得到發酵黃豆渣中可溶性膳食纖維最佳實驗方案是：菌種比例2.02，發酵時間45.35h，發酵溫度26.41 ℃，SDF 的得率達到22.73%。考慮到可操作性，將最優條件定位菌種比例2 ∶1，發酵時間45.5 h，發酵溫度26.4℃。用此最優條件進行驗證實驗，得到可溶性膳食纖維的得率為22.94%，與理論值較為接近，相對誤差為0.94%，小于1%，由此表明實際提取率與回歸方程所預測理論值相吻合。

2.3 冷凍干燥產品特性

對最佳工藝條件（菌種比例2∶1，發酵時間45.5 h，發酵溫度26.4 ℃）下的產品進行成分組成分析、感官評定，得到：DF 得率為52.67%，SDF 得率為22.76%，SDF 約占DF 的43.21%；產品淡黃色，粉末顆粒度小，質地均勻，口感細膩，氣味淡香。

3 結論

圖4 發酵時間（B）和發酵溫度（C）對SDF 得率的等高線和響應面圖Fig.4 Contour plots s and Response surface plot for the effect of fermentation temperature（B）an d fermentation time（C）on SDF yield

以豆渣為原料采用黑曲霉與綠色木霉進行混合發酵制備高活性膳食纖維的方案是可行的。在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 設計，并使用Design-Expert.8.0.6 軟件建立響應面法模型，方差分析表明其回歸方程擬合性較好，得到發酵豆渣中可溶性膳食纖維最佳提取工藝條件為：菌種比例2 ∶1，發酵時間45.5 h，發酵溫度26.4 ℃。在此條件下，驗證實驗的實際平均提取率為22.94%，與預測值相對誤差為0.94%，且產品感官淡黃色，粉末顆粒度小，質地均勻，口感細膩，氣味淡香。結果表明實驗選取的混合菌種是合適的，能夠得到較高的水溶性膳食纖維得率，為提高豆渣的綜合利用率及功能性提供了一種更高效的方法。

[1] 陳霞,趙貴興,孫子重.大豆加工副產物-豆渣及油腳的利用[J].黑龍江農業科學,2006,6:57-60

[2] Tamura Y, Takenaka T. Antioxidative activity of water soluble extracts from okara fermented with Bacillus natto and Rizopus oligosporus[J].Journal of Japanese Society of Food Science and Technology,1999,46(9):561-569

[3] Hill M J.Steroid nuclear dehydrogenation and colon cancer[J]．Am J Clin Nutri,1974,27:4475-4479

[4] 張慧,肖志剛,王東.豆渣水溶性膳食纖維提取工藝的研究現狀與展望[J].大豆科技,2011(5):27-30

[5] 王金亭.膳食纖維及其生理保健作用的研究進展[J].現代生物醫學進,2007,7(9):1414-1416

[6] 鄭建仙.功能性食品[M].北京:中國輕工業出版社,1995

[7] 王慶玲,董娟,汪繼亮.豆渣中可溶性膳食纖維提取工藝的研究[J].中國釀造,2011(3):135-137

[8] 柳嘉,李堅斌,劉健,等.響應面法優化豆渣水溶性膳食纖維提取過程的研究[J].食品科技,2011,36(9):276-280

[9] 郭希娟,馬萍,張桂芳.響應面法在可溶性膳食纖維超聲提取中的應用[J].中國食品學報,2012,12(13):104-111

[10] Shari B, Svetlana Z, Jochen W. Molecular weight and degree of acetylation of high-intensity ultrasonicated chitosan[J]. Food Hydrocolloids,2005,19(5):821-830

[11] 徐廣超.豆渣可溶性膳食纖維的制備及功能性的研究[D].無錫:江南大學,2005

[12] 王夫杰,魯緋,張建,等.微生物發酵豆渣食品的研究進展[J].食品工業科技,2007,28(9):212-215

[13] 薛振環,鄧澤元,范亞葦,等.粗壯脈紋孢菌發酵對豆渣中膳食纖維影響的研究[J].食品工業科技,2009,30(3):156-158

[14] 熊俐,吳士業,張永剛,等.綠色木霉發酵制備黃豆渣膳食纖維的研究[J].食品與發酵科技,2010,46(3):75-78

[15] 劉穎,張瑋瑋,王馥.綠色木霉產纖維素酶發酵條件的研究[J].食品工業科技,2008,29(3):128-130