快速提取蕤核葉黃酮類化合物

李雪姣，韓蕾，楊瑞林，朱廣龍，魏學智，*

（1.山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041000；2.山西師范大學分析測試中心，山西臨汾041000；3.華中農業大學植物科學技術學院，湖北武漢430070）

蕤核（Prinsepia uniflora Batal.），薔薇科（Rosaceae）扁核木屬（Prinsepia）的一種多年生落葉灌木，主要分布于山西、河南、內蒙古、陜西、甘肅等地，生長于向陽山坡或者干旱沙丘上，喜光、濕潤，耐旱、耐寒，對環境適應能力較強[1]。蕤核具有很強的抗旱抗逆抗風沙性[2]，對于水土保持有很好的效果，開花期、結果期具有觀賞價值。據《本草綱目》《本草經》等多部典籍記載，根、葉、種子都具有藥用價值，對于藥用機理目前研究較少，主要在蕤核果實營養成分分析[3]、扁核木葉片黃酮提取工藝[4]、引種栽培[5]、蕤核葉片解剖結構和組織化學定位研究[6]等方面有研究。黃酮類化合物是近年來研究的熱點之一，具有很強的抗氧化性，有效清除體內的氧自由基，阻止細胞的退化、衰老，也可抑制癌癥的發生，改善血液循環，降低膽固醇和血糖，提高免疫力，主要的研究有黃酮類化合物的提取、分離純化的方法[7]，以及作用機理[8]。但對蕤核葉黃酮類化合物的研究尚在起步階段，具有廣闊的應用前景和研究價值。

快速溶劑萃取法是一種較新的提取方法，與通常的超聲提取、索氏提取、微波萃取技術等方法相比，具有速度快，效率高，用量少，重復性好[9]等優點。ASE300快速溶劑萃取儀的工作原理是利用高溫高壓來提高萃取率，使用常規的溶劑對固體或半固體樣品進行萃取，可以進行痕量有機物的處理[10]，應用領域廣泛，如海面溢油[11]，農藥殘留[12]，土壤成分分析[13]，刑事技術[14]等。

1 材料試劑與儀器

1.1 實驗材料與試劑

蕤核葉片：采集于山西省臨汾市城西龍祠村。蘆丁標品：國藥集團化學試劑有限公司；純水：自制；C2H5OH、NaNO2、NaOH、Al（NO3）3，所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

ASE300 型快速溶劑萃取儀：戴安公司；WFJ-7200型可見光分光光度計：上海龍尼柯儀器有限公司；FA1004A 型電子天平：上海維菱科學儀器有限公司；101-3BS 型電熱鼓風干燥箱：金壇市榮華儀器制造有限公司；DELI-500A 型中藥粉碎機：廣州大祥電子機械設備有限公司。

2 方法

2.1 材料預處理

于10月份選取長勢較茂盛的植株，將其葉片進行采摘，洗凈晾干，放置在烘箱中50 ℃～60 ℃烘干，粉碎過篩（60 M）后置于冰箱中保存備用。

2.2 標準曲線的制作與繪制

參照梁曉華，徐成東，王陸琴[15]總黃酮的測定方法。

稱取蘆丁標準液5.0 mg，用濃度60%微熱乙醇溶液定容至50 mL，搖勻得濃度為0.1 mg/mL 的標準液。準確吸取標準應用液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于6 只比色管中，加濃度30%乙醇至5 mL，加濃度5%NaNO2溶液0.3 mL 搖勻，放置6 min，加濃度10 %Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，加濃度1 mol/L NaOH 溶液4 mL，加水0.4 mL，搖勻靜置15 min，以試劑作為空白參比液，于510 nm 波長處測定吸光度A。以吸光度值A 為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，求取線性方程。

得出線性回歸方程：A=0.011 3C+0.000 5 （R2=0.999 8）

2.3 蕤核葉黃酮類化合物的提取與測定

本實驗以乙醇-水為提取溶劑，選用ASE300 來提取蕤核葉黃酮類化合物。準確稱取預處理的蕤核葉粉末，置于萃取池安放到位，收集瓶、廢液瓶置于托盤上。溶劑瓶中注入無水乙醇、純水（預先脫氣）。建立ASE300 提取的方法表、計劃表，裝載運行。

樣品含量測定：準確吸取提取液0.2 mL 置于干凈的試管中，加濃度30%的乙醇至5 mL，按標準曲線的制備方法測定吸光度A。

2.4 單因素試驗

本試驗確定樣品質量為1 g，乙醇作為溶劑，萃取池規格34 mL，在系統壓力1 500 psi，氮氣吹掃90 s 的條件下對爐體加熱溫度、溶劑濃度、靜態萃取時間、提取循環次數4 個單因素進行考察。

2.5 正交設計

黃酮類化合物的提取過程受多個因素影響，為了得到較科學的提取工藝條件，將溶劑濃度、爐體加熱溫度、靜態萃取時間及循環次數四個單因素作為考察對象，設計四因素三水平L9（34）的正交試驗，優化提取工藝。

3 結果與分析

3.1 乙醇濃度對提取蕤核葉黃酮類化合物的影響

設定乙醇濃度40%、50%、60%、70 %、80 %，爐體加熱溫度80 ℃，靜態萃取5 min，萃取循環1 次。測定吸光值并計算得率，研究不同乙醇溶液體積分數對黃酮提取率的影響，結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids

從圖1 曲線可以看出，當乙醇濃度在40%～60%之間隨著濃度的升高提取率逐漸上升，當溶劑的濃度為60%時提取率最高，當濃度大于60%時提取率反而隨著溶劑濃度的升高逐漸降低，黃酮類化合物不是單純的脂溶性有機物，有一定的親水性，單純有機溶劑或水溶液提取的效率都很低。本試驗選擇乙醇和水按比例混合后作為，因此提取蕤核葉黃酮的溶劑濃度選取50%、60%、70%3 個水平。

3.2 爐體加熱溫度對提取蕤核葉黃酮類化合物的影響

設定爐體加熱溫度70、80、90、100、110、120 ℃，溶劑為60%乙醇，靜態萃取5 min，循環1 次。測定吸光值并計算得率，研究不同爐體加熱溫度對黃酮提取率的影響，結果見圖2。

圖2 爐體加熱溫度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of fumace heating temperature on yield of flavonoids

從圖2 曲線走勢可以看出，爐體加熱溫度對提取蕤核葉片的影響趨勢，100 ℃時黃酮得率最高，在溫度低于100 ℃的階段提取率基本呈上升趨勢，超過100 ℃以后黃酮得率反而下降。溫度過高可能會破壞黃酮類化合物的結構而降低提取率。所以爐體加熱溫度選取90、100、110 ℃3 個水平。

3.3 靜態萃取時間對提取蕤核葉黃酮類化合物的影響

設定靜態萃取時間3、5、7、9、11 min，溶劑為60%乙醇，爐體加熱溫度100 ℃，萃取循環1 次。測定吸光值并計算得率，研究不同靜態萃取時間對黃酮提取率的影響，結果見圖3。

圖3 靜態萃取時間對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of static extration time on yield of flavonoids

圖3 趨勢線顯示，靜態萃取的時間對提取率的影響整體呈現上升趨勢，時間達到9 min 時提取率最高，隨著時間的延長提取率未呈現明顯升高趨勢，考慮到節省原料及實驗周期。所以靜態萃取時間選擇7、9、11 min 3 個水平。

3.4 循環次數對提取蕤核葉黃酮類化合物的影響

設定萃取循環次數1、2、3、4、5 次，溶劑為60%乙醇，爐體加熱溫度100 ℃，靜態萃取9 min。測定吸光值并計算得率，研究不同循環次數對黃酮提取率的影響，結果見圖4。

圖4 循環次數對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of the number of cycles on yield of flavonoids

從圖4 的曲線可以看出，提取的循環次數為1 次和2 次時提取率都比較低，當循環3 次時比較高，之后的4、5 次提取率幾乎不上升。將蕤核葉片循環提取3次后，提取率達到5.4%，葉片幾乎為白色，增加循環次數提取率幾乎不變，所以循環萃取3 次為最佳狀態，更利于節約實驗材料和能源。所以快速提取蕤核葉片中黃酮時選擇循環次數為2、3、4 次。

3.6 正交分析

采用L9（34）正交設計表對單因素結果進行安排實驗，優化提取的工藝條件。因素水平表見表1，結果見表2。

表1 因素水平表L9（34）Table 1 The factor levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果L9（34）Table 2 The results of orthogonal test

續表2 正交試驗結果L9（34）Continue table 2 The results of orthogonal test

從表2 結果可以看出，通過均值直觀分析，得出ASE300 快速萃取蕤核葉片黃酮類化合物的因素水平組合為：A2B3C1D2。極差分析得出，4 個因素對提取率的影響，爐體加熱溫度和乙醇濃度對提取的影響較為明顯，靜態萃取時間和循環次數的影響相對較小，即B＞A＞C＞D。

4 結論

使用ASE300 快速溶劑萃取儀提取蕤核葉片中的黃酮類化合物，經過單因素試驗及正交設計的優化，得到最佳的提取工藝條件：萃取溶劑為60%乙醇，爐體加熱溫度110 ℃，靜態萃取7 min，循環提取3 次，得出提取率為8.98%。爐體加熱溫度對提取率的影響最大，其次是乙醇濃度，靜態萃取時間和提取循環次數相對較小。

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