嗜酸乳桿菌直投式發酵劑的制備及工藝條件的優化

王金菊，楊加懷，蔚釧，王艷萍

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457）

乳酸菌發酵劑是指用于酸奶、發酵豆乳、干酪及其他發酵制品生產用的乳酸菌培養物。發酵劑的研究經歷了天然發酵劑（即自然發酵）到繼代式發酵劑（即傳統液體發酵劑）再到直投式發酵劑的發展階段[1]。天然發酵劑的菌種復雜，易產生多種風味物質，發酵產品風味獨特，但同時存在太多不確定因素，產物難以控制，產品中的腐敗細菌還會降低產品的貯藏穩定性[2]。繼代式發酵劑由于在生產發酵制品時，菌株需要母發酵劑經過活化、擴培，到中間發酵劑，從而制成大產量的工作發酵劑，生產過程復雜，技術要求極為嚴格，菌株易退化，還容易被雜菌污染，導致成本高、制備工藝繁瑣、產品質量難以控制，從而影響產品品質[3]。

在人們迫切需要一種高效的發酵劑的背景下，直投式發酵劑應運而生。直投式乳酸菌發酵劑是指經篩選的優良的發酵用乳酸菌不經過復雜的前期活化、擴培過程，可直接進行產品發酵的發酵劑，這種發酵劑是發酵用菌株經過高度濃縮，再與保護劑充分混合后，再經干燥技術干燥后而得到的培養物[4]。

經此工藝制備的發酵劑，與傳統繼代式發酵劑相比：菌體濃度高，可減少用量；占用空間小，便于運輸；保存時間長，在4 ℃條件下可保存一年以上；發酵能力強，可直接投入到原料中進行發酵而不需要復雜的活化過程，操作簡單，減少活化過程中感染雜菌的機率，同時也可降低對于生產條件的要求[5]。

直投式發酵劑經過標準化流程生產，菌株組成穩定，發酵出的產品品質統一，同時由于減化了活化環節，可相應減少工廠在菌種車間的投資和空間以及菌株的污染機率，使發酵的生產更加專業、規范和統一，非常適合工業化生產，進而使發酵產業標準化。

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜酸乳桿菌W-536（Lactobacillus acidophilus W-536）（以下簡稱W-536 菌）由天津科技大學食品生物技術研究室保藏。

1.2 主要試劑及培養基

脫脂奶粉：天津雀巢有限公司，其它試劑皆為國產生化試劑。

MRS 培養基：蛋白胨1.0 g，牛肉膏1.0 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖2.0 g，吐溫80 0.1 g，K2HPO40.2 g，乙酸鈉0.5 g，檸檬酸銨0.2 g，MgSO40.02 g，MnSO40.005 g，蒸餾水定容到100 mL，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

菌落計數培養基：在MRS 液體培養基中加入2.5%瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器與設備

Avanti J-E 型柜式冷凍離心機：美國Beckman；三洋MPF-U4086S 型超低溫冰箱：日本三洋株式會社；Nikon 光學顯微鏡YS-100：日本尼康；高壓干燥滅菌鍋：日本Yamato 公司；YC-015 噴霧干燥機：上海雅程儀器設備有限公司；掃描式電子顯微鏡：日本日立公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 直投式發酵劑干燥方式的確定

目前制備直投式發酵劑的兩種主要干燥方式為噴霧干燥技術和冷凍干燥技術，真空冷凍干燥技術所用設備昂貴而且能源消耗也高，其制備的直投式發酵劑的成本較高。與真空冷凍干燥技術相比，噴霧干燥技術因其具備設備低廉、能源消耗低、易于推廣、有利于大規模連續生產等優點，受到了研究者們越來越多的關注。故本研究選擇噴霧干燥技術來制備嗜酸乳桿菌直投式發酵劑。其主要的制備工藝如下：

高密度乳酸菌發酵液→離心收集菌體→加入保護劑→噴霧干燥

1.4.2 直投式發酵劑制備工藝的優化

1.4.2.1 抗熱保護劑的確定

1）單因素試驗

嗜酸乳桿菌抗熱能力較差，因此要選擇合適的抗熱保護劑在噴霧干燥過程中對其進行保護。目前常用的保護劑主要有糖類、多元醇類、氨基酸類、感膠離子鹽類、蛋白質及肽類，本試驗中的保護劑以脫脂奶粉為基礎保護劑，再分別加入谷氨酸鈉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、β-糊精、多孔糊精、海藻酸鈉、明膠。通過水浴模擬試驗[6]，對這幾種抗熱保護劑的抗熱能力進行研究。方法為：取10 mL 高密度乳酸菌發酵液加入10 mL 保護劑，混勻后，沸水浴30 min，測定混合液中的活菌數。其中保護劑的制備方法為：8%保護劑和20%脫脂奶粉溶于蒸餾水中，115 ℃滅菌20 min。

2）抗熱保護劑的正交優化試驗

采用正交試驗設計L9（33）優化單因素試驗結果中抗熱效果較好的蔗糖和糊精，以及脫脂奶粉這三個因素，每種因素選擇3 個水平，以沸水浴后混合液中的活菌數為指標，確定最佳組合，試驗因素及水平安排見表1。

表1 最佳抗熱保護劑優化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of protectants in the orthogonal experiment

1.4.2.2 噴霧干燥條件的確定1）離心條件的確定

根據實驗室前期研究，選定發酵液的離心條件為3 000 g，離心20 min。

2）單因素試驗

①噴霧干燥機進口溫度對直投式發酵劑的影響

將噴霧干燥機進口溫度分別控制在100、110、120、130、140、150 ℃，進樣流速控制為60 mL/h，離心后菌體與保護劑的配比控制為1 ∶10 進行噴霧干燥，測定發酵劑的活菌數。

②噴霧干燥機進樣流速對直投式發酵劑的影響

將噴霧干燥機進口溫度控制在120 ℃，進樣流速為50、55、60、65、70 mL/h，離心后菌體與保護劑的配比控制為1 ∶10 進行噴霧干燥，測定發酵劑的活菌數。

③菌體與保護劑配比對直投式發酵劑的影響

將噴霧干燥機進口溫度控制在120 ℃，進樣流速為55 mL/h，離心后菌體與保護劑配比分別為：1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），進行噴霧干燥，測定發酵劑的活菌數。

1.4.2.3 噴霧干燥條件的響應面分析

根據單因素試驗結果，應用CCD 中心組合試驗設計原理，進一步分析噴霧干燥中進口溫度、進樣流速、離心后菌體與保護劑配比這3 個因素對直投式發酵劑活菌數的影響，以直投式發酵劑的活菌數為響應值，進行3 因素3 水平的響應面分析試驗，確定噴霧干燥的最佳條件，試驗因素及水平安排見表2。

表2 響應面分析因素及水平表Table 2 Factors and levels of response surface method（RSM）

1.4.3 嗜酸乳桿菌直投式發酵劑發酵活力的測定

采用真空方式對嗜酸乳桿菌直投式發酵劑進行封存，并將其儲存于4 ℃冰箱，定期測定其活菌數。

2 結果與討論

2.1 抗熱保護劑的確定

2.1.1 單因素試驗

嗜酸乳桿菌抗熱能力較差，因此要選擇合適的保護劑在噴霧干燥過程中對其進行保護。本試驗選擇保護劑分別為谷氨酸鈉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、β-糊精、多孔糊精、海藻酸鈉、明膠。利用水浴模擬試驗，確定其抗熱能力。其結果如表3 所示。

表3 不同保護劑對嗜酸乳桿菌的保護作用Table 3 Different protectants on protection of Lactobacillus acidophilus

由表3可知，蔗糖和糊精對嗜酸乳桿菌的保護效果最明顯。糖類物質具有替代水分子以及形成玻璃態的能力，在干燥過程中保護細胞膜維持蛋白質結構的穩定，從而起到很好的作用，同時對蛋白質、脂質體等生物系統的噴霧干燥有抑制損傷的作用[7]。因此選擇蔗糖、糊精和脫脂奶粉進行進一步的優化，以確定最優組合。

2.1.2 抗熱保護劑的正交優化試驗

正交試驗設計L9（33）優化單因素試驗結果中抗熱效果較好的蔗糖和糊精，以及脫脂奶粉的添加量因素，正交結果見表4。

表4 最佳抗熱保護劑優化正交試驗結果Table 4 Results and analysis of orthogonal for protectants experiment

由表4可知，3個因素中，對嗜酸乳桿菌的影響順序為：C（脫脂奶粉）＞B（糊精）＞A（蔗糖），最佳增菌培養基配方為A2B3C2，即8%蔗糖，10%糊精，30%脫脂奶粉。由于此保護劑與高密度發酵液按1 ∶1 混合，則噴霧干燥用時的保護劑的配比為4%蔗糖，5%糊精，15%脫脂奶粉。

2.2 噴霧干燥條件的確定

2.2.1 噴霧干燥機進口溫度對發酵劑的影響

將噴霧干燥機進口溫度分別控制在100、110、120、130、140、150 ℃，進樣流速控制為60 mL/h，離心后菌體與保護劑的配比控制為1 ∶10 進行噴霧干燥，測定發酵劑的活菌數。

表5 進口溫度對發酵劑的影響Table 5 Effect of inlet air temperature on spray-drying starter

由表5可知，發酵劑的活菌數隨著進口溫度的升高，是一個先增加而后降低的趨勢。原因是：進口溫度過低時，干燥程度過低，導致發酵劑含水量過高，使發酵劑過多的黏附在噴霧干燥機中，且含水量也導致發酵劑活菌數的降低。進口溫度過高，單位時間內提供的熱量就越多，由于嗜酸乳桿菌抗熱能力較差，雖然水分蒸發會帶走大量的熱量，抗熱保護劑會對嗜酸乳桿菌起一定的保護作用，但過多的熱量還是會導致嗜酸乳桿菌在噴霧干燥過程中大量死亡。所以本試驗中合適的進口溫度在120 ℃左右。

2.2.2 噴霧干燥機進樣流速對發酵劑的影響

將噴霧干燥機進口溫度控制在120 ℃，進樣流速控制為50、55、60、65、70 mL/h，離心后菌體與保護劑的配比控制為1 ∶10 進行噴霧干燥，測定發酵劑的活菌數。

表6 進樣流速對發酵劑的影響Table 6 Effect of material flow rate on spray-drying starter

由表6 可知，隨著進樣流速的增加，發酵劑的活菌數是一個增加后降低的趨勢。原因是：當進樣流速過低時，嗜酸乳桿菌在噴霧塔中停留時間就會過長，單位樣品承受的熱量過大，使嗜酸乳桿菌大量死亡。而進樣流速過高，會導致單位時間內發酵劑水分蒸發量減少，使發酵劑過多的黏附在噴霧干燥機中，且含水量也導致發酵劑活菌數的降低。本試驗中合適的進樣流速為55 mL/h 左右。

2.2.3 菌體與保護劑配比對發酵劑的影響

將噴霧干燥機進口溫度控制在120 ℃，進樣流速控制為55mL/h，離心后菌體與保護劑配比分別為：1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），進行噴霧干燥，測定發酵劑的活菌數見表7。

表7 菌體與保護劑配比對發酵劑的影響Table 7 Effect of different content of bacteria and protectants on spray-drying starter

抗熱保護劑的添加能在嗜酸乳桿菌表面形成保護層，減少菌體暴露于空氣介質中的面積，減少由于細胞壁損壞而引起胞內物質的泄漏，從而起到保護作用。由表7 可知，隨著抗熱保護劑添加量的增加，發酵劑的活菌數是一個先增加后降低的趨勢。當抗熱保護劑的添加量過低時，其對菌體的包裹程度不夠，使菌體過多的暴露在高溫下，導致菌體大量死亡。當抗熱保護劑添加量過高時，單位樣品中菌體數會相對減少，同時樣品溶液過于黏稠，也不利于噴霧干燥。本試驗中的菌體與保護劑的合適配比為1 ∶30 左右。

2.3 噴霧干燥條件的響應面分析

2.3.1 發酵劑活菌數二次模型方程的建立與檢驗

根據單因素試驗結果，應用CCD 中心組合試驗設計原理，對噴霧干燥的進口溫度、進樣流速、離心后菌體與保護劑配比這3 個因素，進行3 因素3 水平響應面分析，結果見表8。

通過Design Expert 軟件對表中試驗數據進行二次多項回歸擬合，發酵劑活菌數對進口溫度、進樣流速以及菌體與保護劑配比的二次多項式回歸方程為：

表8 響應面試驗結果Table 8 Results of RSM experiments

Y=13.02-0.29A-0.25B-0.63C-0.40AB+0.075AC+0.100BC-1.86A2-1.79B2-1.58C2

式中：Y 為預測相應值，A、B、C 分別為進口溫度、進樣流速以及菌體與保護劑配比的編碼值。該二次回歸方程方差分析結果見下表9。

表9 CCD 試驗方差分析Table 9 Variance analysis of CCD experiment

2.3.2 發酵劑活菌數的響應面交互作用與優化

2.3.2.1 進口溫度與進樣流速的交互影響

圖1 顯示了進口溫度和進樣流速對嗜酸乳桿菌發酵劑活菌數的交互影響，在進樣流速不變的條件下，隨著進口溫度的增加，嗜酸乳桿菌發酵劑的活菌數先上升后下降的趨勢變化比較顯著，這是由于溫度逐漸升高，干燥效果較好，發酵劑的活菌數較高；但溫度繼續升高，嗜酸乳桿菌逐漸失活，造成發酵劑活菌數下降。在進口溫度不變的條件下，隨著進樣流速的增加，嗜酸乳桿菌發酵劑的活菌數也出現了先上升后下降的趨勢。

圖1 （a，b）進口溫度和進樣流速對發酵劑活菌數影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 （a，b）Contour and response surface plots showing the interactive effects of inlet air temperature and material flow rate on spray-drying starter

2.3.2.2 進口溫度和菌體與保護劑配比的交互影響

圖2 顯示了進口溫度和菌體與保護劑配比對嗜酸乳桿菌發酵劑活菌數的交互影響。在進口溫度不變的條件下，隨著保護劑添加量的增大，發酵劑活菌數出現先上升后下降的趨勢明顯，這是由于保護劑的添加能在嗜酸乳桿菌表面形成保護層，減少菌體暴露于空氣介質中的面積，減少由于細胞壁損壞而引起胞內物質的泄漏，從而起到保護作用，但是隨著保護劑添加量的不斷增大，單位樣品中菌體數會相對減少，而且樣品黏稠度增大，損失在噴霧干燥機中的也越多。在菌體與保護劑配比不變的條件下，隨著進口溫度的不斷增加，發酵劑活菌數也出現先上升后下降的明顯趨勢。

圖2 （a，b）進口溫度和菌體與保護劑配比對發酵劑活菌數影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 （a，b）Contour and response surface plots showing the interactive effects of inlet air temperature and different content of bacteria and protectants on spray-drying starter

2.3.2.3 進樣流速和菌體與保護劑配比的交互影響

圖3 顯示了進樣流速和菌體與保護劑配比對嗜酸乳桿菌發酵劑活菌數的交互影響。

在菌體與保護劑配比不變的條件下，隨著進樣流速的增大，發酵劑活菌數的變化是先增大后減小的趨勢。這可能是由于當進樣流速過低時，嗜酸乳桿菌在噴霧塔中停留時間就會過長，單位樣品承受的熱量過大，使嗜酸乳桿菌大量死亡。而進樣流速過高，會導致單位時間內發酵劑水分蒸發量減少，使發酵劑過多的黏附在噴霧干燥機中，且含水量也導致發酵劑活菌數的降低。當進樣流速不變的條件下，隨著保護劑添加量的增加，發酵劑活菌數先增大后減小的趨勢明顯。

圖3 （a，b）進樣流速和菌體與保護劑配比對發酵劑活菌數影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 （a，b）Contour and response surface plots showing the interactive effects of material flow rate and different content of bacteria and protectants on spray-drying starter

經CCD 響應面設計優化后嗜酸乳桿菌發酵劑噴霧干燥的最佳條件為：進口溫度119.23℃，進樣流速54.66 mL/h，菌體與保護劑配比1 ∶27.95。最大值為13.1×108cfu/g。

根據工業化生產中噴霧干燥塔的實際操作要求，將噴霧干燥的最佳條件定為：進口溫度119 ℃，進樣流速55 mL/h，菌體與保護劑配比1 ∶28。

2.4 驗證試驗

按照預測的最佳噴霧條件做重復試驗，三次試驗得到嗜酸乳桿菌發酵劑的活菌數為1.67×109cfu/g，說明該模型能較好的反映實際情況。

2.5 嗜酸乳桿菌直投式發酵劑掃描電鏡結果

利用掃描電鏡觀察了嗜酸乳桿菌直投式發酵劑以及改良MRS 培養基中的菌體和直投式發酵劑復水后的菌體的變化，如圖4。

圖4 嗜酸乳桿菌直投式發酵劑掃描電鏡圖（×3K）Fig.4 Scanning electron micrographs of DVS of Lactobacillus acidophilus（×3K）

圖4 顯示了嗜酸乳桿菌直投式發酵劑的表征，干燥后的發酵劑主要呈不規則球形，少數菌體會很小的一部分暴露出保護劑面，大部分菌體被包裹在保護劑之中，在保護劑之外沒有觀察到完整的菌體，表明只有被保護劑包裹的菌體才可以在高溫干燥后存活下來，這也說明需要添加足夠量保護劑，才能包裹盡量多的菌體。

2.6 嗜酸乳桿菌直投式發酵劑儲存穩定性的測定

表10 顯示的是嗜酸乳桿菌直投式發酵劑在4 ℃真空包裝儲存半年的活菌數變化。

表10 嗜酸乳桿菌直投式發酵劑儲存穩定性的測定Table 10 The storage experiment of Lactobacillus acidophilus spray-drying starter

由表10 可知，噴霧干燥技術制備的嗜酸乳桿菌直投式發酵劑具有較高的活菌數，儲存1 個月后仍具有較高菌活，活菌數為1.32×109cfu/g，儲存半年后活菌數仍可達到9.2×108cfu/g，仍可達到106cfu/g，表明4 ℃真空包裝儲存方式良好。

3 結論

通過單因素和正交試驗，確定了抗熱保護劑的最佳配比為：4%蔗糖，5%糊精，15%脫脂奶粉。通過單因素和響應面分析法，確定了噴霧干燥技術制備嗜酸乳桿菌直投式發酵劑的最佳工藝參數：進口溫度119 ℃，進樣流速55 mL/h，菌體與保護劑配比1 ∶28。制備出的嗜酸乳桿菌直投式發酵劑的活菌數為1.67×109cfu/g。

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