大理野生橄欖多糖、總黃酮和總多酚的含量測定

羅永會，張翠香，徐春萍

（大理學院基礎醫學院生物化學與分子生物學實驗室，云南大理671000）

大理野生橄欖屬滇橄欖（Phyllanthus emblica L.），是大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）植物余甘子（Phyllanthus emblica L.）的果實。在大理野生橄欖果實以常生食或鹽漬后食用，入口酸甜微澀，回味甘甜，故名余甘，又名喉甘子，庵羅果，牛甘果等。余甘子含有豐富的多糖及維生素、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）及多酚類物質等活性物質和人體必需的微量元素等[1]。橄欖藥用價值豐富，為我國傳統中藥材，具有清熱涼血、消食健胃和生津止咳、抗腫瘤、延緩衰老、增強心血管功能、治療慢性前列腺炎、增強免疫力、調節內分泌系統、護肝、抗炎、抗過敏、抑菌、抗病毒等功效[2]。主要用于治療發熱咳嗽、煩熱口干、消化不良、慢性肝炎、肥胖、高脂血癥，是衛生部公布的“藥食同源”品種之一，也是聯合國衛生組織指定為世界推廣種植的3 種保健植物之一[3-6]。本文以大理豐富的野生橄欖為原料，通過實驗提取并測定大理野生橄欖果實中的可溶性多糖、黃酮及多酚類化合物的含量，以期為大理野生橄欖的開發應用提供參考數據。

1 儀器和材料

1．1 材料和試劑

新鮮野生橄欖購于云南大理市農貿市場，產于云南省大理蒼山。

蘆丁（國藥集團）、葡萄糖、沒食子酸、石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、無水乙醇、濃硫酸、苯酚（洛陽市化學試劑廠生產），均為分析純。

1.2 主要儀器

BT-224S 型電子分析天：德國賽多利斯儀器公司；HH－4 數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；TDL－4A 低速離心機：上海菲恰爾儀器有限公司；722E分光光度計：上海分析儀器有限公司；RA－6000 旋轉蒸了儀：上海亞榮生化儀器廠；中藥粉碎機。

2 方法

2.1 樣品處理

野生橄欖洗凈，去核，60 ℃干燥24 h，粉碎。稱取100 g 野生橄欖粉，加入10 倍體積的石油醚，65 ℃水浴回流2 h，重復2 次，脫脂及去除色素，室溫揮干有機溶劑，干燥得脫脂野生橄欖樣品，備用。

2.2 待測樣品的制備

精確稱取0.500 g 脫脂橄欖樣品置于250 mL 三角燒瓶中，加入100 mL 去離子水或60%乙醇，用保鮮膜封緊瓶口，置于沸水浴或置于40 ℃水浴（加入60%乙醇則置于40 ℃水浴）浸提2 h～3 h，過濾，重復1 次，合并濾液得待測樣品溶液。

2.3 大理野生橄欖多糖的測定

2.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖105℃干燥至恒重，稱取10.0 mg，用去離子水定容至100.0 mL，則葡萄糖標準液濃度為0.1mg/mL。準確吸取對照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的葡萄糖標準液，分別加水至2.0 mL，各加1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，再加5.0 mL 濃硫酸，放置5 min，置于沸水浴中加熱15 min，冷至室溫，以第1 管為空白，于490 nm 處測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[7]。

2.3.2 樣品中多糖的測定

取1.0 mL 待測樣品，參照2.3.1 方法操作測定490 nm 處吸光度，代入線性回歸方程，求出樣品多糖的濃度，計算橄欖中多糖含量：

式中：C 為樣品中多糖的濃度，根據標準曲線算出；V 為樣品稀釋后的體積；m 為樣品的質量。

2.4 野生橄欖總黃酮的測定

2.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁標準品52.8 mg，用60%乙醇定容至100 mL，則蘆丁標準液的濃度為0.528 mg/mL 準確吸取對照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別加60%乙醇至2.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，放置6min 后加5%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，混勻，放置15 min 加60%乙醇至10.0 mL，以第1 管為空白對照，于510 nm 處讀取吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[8]。

2.4.2 樣品中總黃酮的測定

精密吸取1.0 mL 待測樣品參照2.4.1 方法，配制樣品液，于510 nm 處讀取吸光度，代入線性回歸方程，救出樣品黃酮濃度，計算橄欖中總黃酮的含量：

式中：C 為樣品中黃酮的濃度，根據標準曲線算出；V 為樣品稀釋后的體積；m 為樣品的質量。

2.5 野生橄欖總多酚的測定

2.5.1 沒食子酸標準曲線的繪制

精確稱取10.00 mg 沒食子酸標準品，用去離子水定容至100 mL，則沒食子酸標準液濃度為0.1 mg/mL。準確吸取對照品溶液0.0、0.7、1.4、2.1、2.8、3.5 mL，分別加去離子水至5.0 mL，混勻，加入3.0 mL 酒石酸鐵溶液，加磷酸緩沖液至10.0 mL 混勻，以第1 管為空白對照，于540 nm 處讀取吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

2.5.2 橄欖總多酚的測定

精密吸取1.0 mL 待測樣品參照2.5.1 方法，配制樣品液，于540 nm 處讀取吸光度，代入線性回歸方程，救出樣品多酚濃度，計算橄欖中總多酚的含量：

式中：C 為樣品中多酚的濃度，根據標準曲線算出；V 為樣品稀釋后的體積；m 為樣品的質量。

3 結果分析

3.1 對照品標準曲線

3.1.1 葡萄糖對照品標準曲線

用苯酚－硫酸法測定吸光度，并以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：y=0.014 6x+0.039 4（R2=0.998 2），葡萄糖濃度在：20 μg～100μg 范圍內標準曲線呈良好線性關系如圖1。

圖1 葡萄糖標準線（490 nm）Fig.1 Standard curve of glucose（490 nm）

3.1.2 蘆丁對照品標準曲線

采用NaNO2-AINO3-NaOH 法測定吸光度，并以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：y=0.010 8x+0.005 9（R2=0.999 8），蘆丁濃度在：20 μg～105 μg 范圍內標準曲線呈良好線性關系如圖2。

圖2 蘆丁標準線（510 nm）Fig.2 Standard curre of rntin（510 nm）

3.1.3 焦性沒食子酸標準曲線

采用灑石亞鐵法測定吸光度，并以焦性沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：y=0.016 6x+0.017 6（R2=0.998 5），焦性沒食子酸濃度在：14 μg～70 μg 范圍內標準曲線呈良好線性關系如圖3。

圖3 沒食子酸標準線（540 nm）Fig.3 Standard curre of pyrogallic acid（540 nm）

3.2 大理野生橄欖中多糖及總黃酮和總多酚含量

本實驗分別用去離子水沸水浴和60%乙醇40 ℃水浴浸提2 h～3h，以葡萄糖、蘆丁及焦性沒食子酸作為對照品，分別采用苯酚－硫酸法，NaNO2-AlNO3-NaOH 法，灑石亞鐵法測定大理野生橄欖中多糖、總黃酮及總多酚的含量如表1。

表1 大理野生橄欖中多糖及總黃酮和總多酚的含量（n=5）Table 1 Content of the soluble polysaccharide，flavone and polyphenol in Dali in the wild olive（n=5）

由表1 得大理野生橄欖中含有豐富的多酚、多糖及黃酮類物質，用60%乙醇浸提總含量可達（8.98±0.133）%，而用去離子水浸提總含量高達（8.98±0.13）%，其中多酚含量較高，用60 %乙醇浸提高達（5.43±0.232）%，而用去離子水浸提也可達（5.19±0.114）%以上，見圖4。

圖4 橄欖多糖、總黃酮、總多酚的含量與浸提劑的關系圖Fig.4 The content of total polyphenolsolive polysaccharide total fcavonoids and leaching agent relationship

4 討論

本實驗分別以葡萄糖、蘆丁和焦性沒食子酸為對照品用苯酚-硫酸法、NaNO2-AlNO3-NaOH 法，灑石亞鐵法分別測定大理野生橄欖中多糖，總黃酮和總多酚的含量，方法快捷、簡單，穩定并且在一定范圍內線性關系良好。用去離子水沸水浴浸提測得大理野生橄欖中多糖，總黃酮和總多酚含量分別為：（3.02±0.105）%、（0.78±0.081）%、（5.19±0.114）%；而用60%乙醇40 ℃水浴浸提測得大理野生橄欖中多糖，總黃酮和總多酚含量分別為：（2.38±0.675）%、（0.58±0.074）%、（5.43±0.232）%。結果表明大理野生橄欖含有豐富的抗氧化成分多糖、黃酮和多酚類物質，是一種藥食同源的綠色食品。且多糖和黃酮的提取用水優于用乙醇，而總多酚的提取用乙醇較好。 有關大理野生橄欖多糖、黃酮及總多酚的提取及生物活性有待進一步研究。

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