4-甲基亞磺酰丁基硫苷（RAA）合成與代謝及遺傳特性的研究進展

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(1宜昌市農業(yè)科學研究院,湖北宜昌 443004;2宜都市農業(yè)局,湖北宜都 443300;3華中農業(yè)大學園藝林學學院,湖北武漢 430070)

4-甲基亞磺酰丁基硫苷（RAA）合成與代謝及遺傳特性的研究進展

李念祖1☆史明會2，3☆牟 愔1盧夢玲1王友海1*萬正杰3

(1宜昌市農業(yè)科學研究院,湖北宜昌 443004;2宜都市農業(yè)局,湖北宜都 443300;3華中農業(yè)大學園藝林學學院,湖北武漢 430070)

4-甲基亞磺酰丁基硫苷(glucoraphanin,RAA)是具天然抗癌特性的蘿卜硫素的前體,在十字花科蔬菜尤其是青花菜中含量較高,因此對RAA的研究也成為學術界的熱點。本文綜述了RAA的合成與代謝及其遺傳特性的研究進展,同時展望了分子標記在此領域更廣泛的應用前景。

4-甲基亞磺酰丁基硫苷;青花菜;代謝;遺傳特性;綜述

硫苷物質在病蟲害預防、植物保護、蔬菜風味、逆境生理與疾病預防等諸多方面發(fā)揮著重要作用(Aires et al.,2009;Bressan et al.,2009; Agerbirk et al.,2010)。4-甲基亞磺酰丁基硫苷(glucoraphanin,RAA)又稱萊菔子苷,分子式為C12H21NO10S3,分子量為403.29,是脂肪族硫苷的一種。研究發(fā)現(xiàn),青花菜等十字花科蔬菜富含硫苷成分,當植物受到外力破壞、機械損傷或昆蟲咬食時,位于液泡內的硫苷成分會被釋放出來與黑芥子酶(myrosinase)發(fā)生水解反應,生成各種次生代謝產物,如硫氰酸酯、異硫氰酸酯、腈類等(何洪巨等,2002;陳新娟 等,2006;Liang et al.,2006;吳元鋒 等,2009;謝祝捷 等,2010;Agerbirk et al.,2010)。RAA在植物內源黑芥子酶或腸道中微生物群的作用下降解為具有生物活性的蘿卜硫素(sulforaphane)。試驗證明,蘿卜硫素具有極強的抗癌特性,主要表現(xiàn)在抗氧化功能、消炎特性、誘導細胞凋亡和細胞周期性死亡等方面(Juge et al., 2007)。

本文主要介紹了RAA在植物體內的合成及代謝,同時綜述了國內外對RAA遺傳特性的研究及最新動態(tài),為深入研究RAA的分子調控機制及高RAA含量青花菜的選育提供參考。

1 RAA的合成與代謝

1.1 RAA的合成

RAA是側鏈來源于蛋氨酸的脂肪族硫苷,其生物合成分為兩個階段：① 側鏈延伸單位——雙高蛋氨酸(DHM)的形成階段。該過程由側鏈延伸機制中的兩個連續(xù)的循環(huán)反應完成。蛋氨酸在細胞質中通過支鏈氨基酸轉移酶4(BCAT4)催化的轉氨反應進入側鏈延伸機制,生成的α-酮酸被轉移到葉綠體。這個階段中由MAM1、BCT4和BCT3催化的反應與亮氨酸的生物合成反應類似,反應物在AC和IPM的催化作用下經過兩個循環(huán)反應后生成2-氧-6-甲基硫代己酸,之后在BCT3催化的轉氨反應下生成DHM(Kroymann et al.,2001; Schuster et al.,2006;Knill et al.,2008;Sawada et al.,2009)。② DHM進入脂肪族硫苷經修飾生成RAA的階段。該反應由細胞質中的8個活性酶(依次為CYP79F1、YP83A1、GGP1、SUR1、AtST5b、FMO、UDP-葡糖基轉移酶和谷胱甘肽轉移酶)催化完成,其中FMO是氨基酸側鏈被硫氧化成RAA這一修飾過程的關鍵酶(Klein et al.,2006;Hansen et al.,2007;Geu-Flores et al.,2009)。

目前,RAA合成過程中相關的主要合成和調節(jié)基因已得到了驗證,分別是由MAM、CYP79/ CYP83、AOP等合成基因家族起決定作用(鄭建仙,2005;周榮漢和段金廒,2005),而轉錄因子MYB基因家族在硫苷的生物合成過程中則起著調節(jié)上述基因表達的作用(Yan & Chen,2007)。

1.2 RAA的代謝

RAA一般貯存在植物液泡中,而黑芥子酶位于特定蛋白體中。正常情況下,兩者相互分離且相對穩(wěn)定。當植物組織受到咀嚼或細胞滲透性增強時,細胞的代謝區(qū)隔遭到破壞,特定蛋白體中的黑芥子酶被釋放出來并與RAA接觸,RAA經黑芥子酶水解產生具有較強抗癌特性的異硫氰酸鹽——SF (鄭建仙,2005)。烹飪過程中,青花菜內源黑芥子酶由于高溫變性失活,但將烹飪后的青花菜喂食無菌小鼠,在其尿液中檢測到了SF(無菌小鼠的腸道內無內源黑芥子酶,且用抗生素進行了腸道處理),表明小鼠盲腸中的微生物群落可以將RAA轉化為SF,進而穿過盲腸壁被吸收;同時也證實了RAA在整個消化系統(tǒng)中是以完整的形式到達盲腸區(qū),中間無代謝反應(Lai et al.,2010)。

2 青花菜中RAA的研究

2.1青花菜中RAA含量的研究

研究表明,青花菜中RAA含量約占脂肪族硫苷含量的80%,占總硫苷含量的62%(Brown et al.,2002)。近年來國內外對不同品種青花菜中RAA含量的研究越來越多。Kushad等(1999)對50個青花菜品種的花球RAA含量進行比較,發(fā)現(xiàn)品種間RAA含量最大相差27倍且差異均達顯著水平;邱海榮等(2008)利用反相高效液相色譜法檢測了3個不同品種青花菜的RAA含量,結果與Kushad等(1999)的研究結果一致;姚雪琴等(2011)對24份青花菜材料的花球、莖和葉片中RAA含量進行測定,結果顯示青花菜不同器官的RAA含量差異極顯著,花球中含量最高,莖次之,葉片最低。以上研究為高RAA含量青花菜品種的選育工作奠定了基礎,同時也為定位RAA高含量表達相關基因提供了平臺。

2.2 RAA含量在青花菜生命周期中的變化

青花菜不同發(fā)育階段及同一階段不同組織中的RAA含量不同。Rangkadilok等(2002)研究指出,青花菜中RAA含量從幼苗期到綠色花球期持續(xù)增長,開花期開始下降。在綠色花球期,青花菜花球中的RAA含量顯著高于其他營養(yǎng)器官;而開花期花球中的RAA含量雖然高于莖和葉柄,但差異不顯著。青花菜種子中的RAA含量也引起了研究者的熱切關注。Lee等(2010)在前人的研究基礎上,以NaClO3為膠粒相,采用膠束動電毛細血管法定量測定了青花菜種子、嫩芽及抱子甘藍嫩芽中的RAA含量,結果顯示青花菜種子中的RAA含量最高(平均為13 300 mg·kg-1),嫩芽次之(890 mg·kg-1),抱子甘藍嫩芽中的RAA含量最低(30 mg·kg-1)。

2.3基因型和環(huán)境互作對青花菜RAA含量的影響

Farnham等(2000)在研究多個青花菜品種的RAA含量時發(fā)現(xiàn),基因型在控制RAA于花球中的表達起重要作用,這與Faulkner等(1998)的研究結果一致。Farnham等(2005)對生長在兩種不同環(huán)境條件下的10個青花菜自交系種子中的RAA含量進行測定,同時還進行了基因型和環(huán)境因素對種子中RAA含量影響的方差分析,結果表明基因型和環(huán)境及兩者的相互作用均對RAA含量具有顯著影響,其中基因型的影響最大。Vallejo等(2003)報道,冬季種植時青花菜栽培品種Marathon的RAA含量是Rosa和Rodrigues的1/3;Abercrombie等(2005)檢測6個參試親本的花球RAA含量,均比1998年的檢測值低,表明基因×環(huán)境的互作對青花菜花球中RAA含量也具有重要影響。謝祝捷等(2010)研究了基因型和環(huán)境互作對青花菜RAA含量的影響,結果顯示基因型對青花菜RAA含量的影響達極顯著水平,其相應的變異來源占總變異來源的67.3%,大于Farnham等(2004)報道的53.8%;栽培地點的影響及其與基因型的互作效應均達顯著水平,而栽培年份及其相關互作效應不顯著,與Brown等(2002)的研究結果相似。

2.4 RAA的遺傳背景

許多野生甘藍種的RAA含量比栽培品種要高(Giamoustaris & Mithen,1996)。Faulkner等(1998)將栽培品種Green Duke與野生甘藍品種進行雜交,雜交后代的RAA含量和誘導苯醌還原酶活性的能力分別是栽培品種的10倍和100倍,原因歸結為野生甘藍品種在基因水平改變了栽培品種的遺傳背景,RAA含量的增加促使其轉化為更多的蘿卜硫素。Mithen等(2003)通過基因滲入的方法,將野生品種中的3個基因片段轉入青花菜栽培品種后,青花菜栽培品種的蘿卜硫素含量明顯提高,這與Farnham等(2000)的研究結果類似,同時也證明基因型在RAA的表達中起重要作用,而控制RAA高水平表達的基因存在于表型優(yōu)良的種質中。

3 RAA的代謝調控

硫苷在蕓薹屬作物中的合成是受基因型和環(huán)境因素共同調節(jié)的數量性狀遺傳,QTL是研究硫苷表達及其含量調控相關基因的有效方法。研究者在模式植物擬南芥中對硫苷的生物合成相關基因和功能特性進行了QTL分析(Kliebenstein et al.,2001a, 2001b;Brown et al.,2003;Textor et al.,2007;Li et al.,2008)。QTL分析表明,AOP和GS-elong (MAM)兩個基因家族在脂肪族硫苷的調控和積累方面起著至關重要的作用,其中MAM在側鏈延伸過程中發(fā)揮作用,而AOP的作用表現(xiàn)在側鏈修飾環(huán)節(jié)(Kliebenstein et al.,2001a;Field et al., 2004;Heidel et al.,2006)。

在擬南芥種間雜交群體Ler×Cvi中找到1個與種子和葉片中總硫苷含量相關的QTL,同時脂肪族硫苷的表達受到6個QTL的共同作用,其中2個位點與AOP和MAM的互作相關(Kliebenstein et al.,2001c),這2個位點在Wentzell等(2007)的研究中得到印證;以擬南芥種間雜交群體Ler×ColRI為研究基礎時,在2條染色體上找到5個與脂肪族硫苷相關的QTL,解釋了總變異的60% (Kliebenstein et al.,2002);而擬南芥種間雜交群體Da(1)×Ei-2中總脂肪族硫苷的表達受3個QTL控制,1個與AOP連鎖,1個在5號染色體頂端,另1個被新定位到1號染色體上(Kroymann et al.,2003)。一系列生態(tài)型擬南芥基因學研究表明,MAM位點位于5號染色體頂端,促使脂肪族硫苷的表達(Kliebenstein et al.,2001a)。Heidel等(2006)在對擬南芥lyrata種間雜交群體中MAM位點進行研究時找到2個與硫苷表達相關的QTL,其中1個是控制脂肪族硫苷比例的QTL,位于MAM位點附近。

但是,在蕓薹屬作物中并沒有得到關于硫苷生物合成、轉運和終產物功能修飾等的具體信息。Uzunova等(1995)在甘藍型油菜DH群體中找到4個與種子總硫苷表達相關的QTL位點,解釋了總表型變異的61%。Toroser等(1995)應用RFLP技術,利用甘藍型油菜DH群體構建連鎖圖,定位到2個主效基因和3個微效基因的QTL位點。這些研究表明種子中總硫苷的生物合成同時受到基因加性效應和上位效應控制,這一結論在對青花菜花球中RAA的遺傳特性進行研究時得以印證(史明會 等,2014)。目前,已在甘藍中克隆出與擬南芥AOP和MAM同源的基因,是甘藍中脂肪族硫苷合成途徑的關鍵因子(Li & Quiros,2003);廖永翠等(2011)在研究大白菜中脂肪族硫苷代謝調控時發(fā)現(xiàn),AOP2的存在引起NAP含量和PRO含量升高,而降低了RAA的生成與積累。除了以上結構基因外,一些轉錄因子也會影響脂肪族硫苷的表達,如IQD1等(Celenza et al.,2005)。盡管環(huán)境和生長因子會影響基因的表達,但基因型是硫苷含量的重要影響因素。

RAA是存在于青花菜中的高含量天然次級代謝物,有研究指出青花菜之所以富含RAA,是因為其基因組中缺少GSL-ALK這一功能位點(Tawfiq et al.,1995)。近年來,研究者們對青花菜中硫苷合成和積累相關基因的定位進行了報道。Mithen等(2003)在青花菜中找到1個與RAA和3-甲基亞磺酰丙基硫苷表達相關的差異性等位基因QTL位點;Sarikamis等(2005)采用微衛(wèi)星定位法將該QTL位點定位到了染色體O2上,同時又在染色體O5上定位到1個新的與硫苷表達相關的QTL位點,但沒有明確控制RAA合成的QTL位點。Gao等(2007)利用青花菜DH系Early-Big和花椰菜DH系An-Nan Early雜交得到的分離群體F2,構建了含有1 257個標記的高密度基因圖譜,發(fā)現(xiàn)多個硫苷合成途徑的相關基因：BoGSL-ELONG被定位在染色體LG2上;BoS-GT在染色體LG3上;BoGSLPROa、BoGSL-PROb和BoCYP79F1在染色體LG5上,前兩者的距離為0.027 cM;BoCS-lyase在染色體LG6上;而BoGSL-ALK和BoGS-OH均在染色體LG9上,兩者的距離為5.4 cM。

4 結論與展望

目前,對RAA的合成、代謝及其遺傳特性已有研究,但是RAA合成途徑的基因網絡非常復雜,整個過程涉及到多個關鍵基因。同時,環(huán)境因素的改變也將影響到硫苷含量的表達,如光質、溫度、鹽脅迫、肥料等,這些非生物因素對RAA含量的影響是通過何種調控途徑來實現(xiàn)的,還需進一步探究。此外,對蕓薹屬脂肪族硫苷含量的調控基因已有大量研究報道,但對青花菜中控制RAA含量表達的基因還未進行精細定位。隨著生物技術的發(fā)展,高通量測序、分子標記技術及基因靶向修飾技術已廣泛應用到各個研究領域,因而運用多種生物技術來探究青花菜中調控RAA含量的相關基因,對高RAA含量青花菜的選育工作具有重要的應用意義。

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Research Progress in Metabolism and Hereditary Traits and Genetic Characteristics of Glucoraphanin

LI Nian-zu1,SHI Ming-hui2,3,MOU Yin1,LU Meng-ling1,WANG You-hai1*,WAN Zheng-jie3

(1Yichang City Institute of Agricultural Sciences,Yichang 443003,Hubei,China;2Yidu City Agriculture Bureau, Yidu 443300,Hubei,China;3College of Horticulture and Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,Hubei,China)

Glucoraphanin is the bioprecursor of sulforaphane with natural chemopreventive and anticarcinogen characteristics．Its content is high in cruciferae vegetables,especially in broccoli．Studies on glucoraphanin have become the hot topics recently．This paper reviews the research progress made at home and abroad on synthesis,metabolism and genetic characteristics of glucoraphanin．The paper also prospects the broader application of molecular marker in this area．

Glucoraphanin;Broccoli;Metabolism;Genetic characteristics;Review

☆兩作者對本文具同等貢獻。

李念祖,男,助理農藝師,專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種與生物技術,E-mail：linianzu@sina.cn

史明會,女,助理農藝師,專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種,E-mail：minghuishi0213@163.com

*通訊作者(Corresponding author)：王友海,男,高級農藝師,專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種,E-mail：337316007@qq.com

2014-07-02;接受日期：2014-08-25

宜昌市農業(yè)科學研究院果蔬創(chuàng)新育種項目