UPLC法同時測定鹽酸阿糖胞苷原料藥的含量和有關物質

海麗萍，楊東菁，王志遠，王雪芹（1.河南省直屬機關第一門診部，鄭州 45000；.河南大學醫學院，河南開封 475001；.河南大學藥學院，河南開封 475001；4.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 45000）

UPLC法同時測定鹽酸阿糖胞苷原料藥的含量和有關物質

海麗萍1＊，楊東菁2，王志遠3，王雪芹4#（1.河南省直屬機關第一門診部，鄭州 450003；2.河南大學醫學院，河南開封 475001；3.河南大學藥學院，河南開封 475001；4.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003）

目的：建立同時測定鹽酸阿糖胞苷原料藥的含量和有關物質的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-3C18，流動相為磷酸鹽緩沖液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.8m l/min，檢測波長為254 nm，柱溫為40℃，進樣量為10μl。結果：尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、鹽酸阿糖胞苷檢測質量濃度分別在0.100 8～20.16、0.1～20.12、0.095 6～19.12、0.1～20.004μg/m l范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.999 9、0.999 8、0.999 9、0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD≤0.79%；尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷平均加樣回收率為103.8%、102.2%、99.7%，RSD分別為2.44%、2.69%、3.16%（n＝9）。結論：該方法準確、靈敏度高、專屬性強、重復性好，可用于鹽酸阿糖胞苷原料藥的質量控制。

鹽酸阿糖胞苷；尿嘧啶；尿苷；阿糖尿苷；超高效液相色譜法；含量測定

＊主管藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0371-65907512

#通信作者：主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析。電話：0371-63388295。E-mail：wangxueqin2008@126.com

阿糖胞苷為嘧啶類抗代謝藥，主要用于治療急性粒細胞白血病及消化道腫瘤，是治療白血病最常見的藥物[1]。鹽酸阿糖胞苷為阿糖胞苷的鹽酸鹽。美國藥典（USP）、英國藥典（BP）等均只收載阿糖胞苷原料藥的檢測質量標準[2-3]，而《中國藥典》2010年版收載了鹽酸阿糖胞苷（原料藥）的檢測質量標準[4]。BP收載的有關物質測定采用薄層色譜（TLC）法，含量測定采用非水滴定法；USP與《中國藥典》收載的有關物質和含量測定均采用高效液相色譜（HPLC）法，但色譜條件有所不同。筆者參照了相關文獻[5-9]，采用超高效液相色譜（UPLC）法同時對鹽酸阿糖胞苷原料藥中主成分和有關物質的含量進行測定，以為其質量控制提供參考。

1 材料

Acquity系列UPLC儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、光電二極管陣列檢測器、Empower工作站（美國Waters公司）；XR205SM-DR電子天平（瑞士Precisa公司）。

鹽酸阿糖胞苷、阿糖尿苷對照品（美國Sigma公司，批號：SLBB7397V、031M 5069V）；尿嘧啶、尿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100469-200401、887-200202）；鹽酸阿糖胞苷原料藥（河南信心制藥有限公司，批號：20120401、20120402、20120403、20120801、20120802、20120803）；甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertsilODS-3C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（流動相A，含0.01mol/L磷酸二氫鈉和0.01 mol/L磷酸氫二鈉）-甲醇（流動相B），梯度洗脫程序見表1；流速：0.8m l/min；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃，進樣量：10μl。

2.2 溶液的制備

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution ofmobile phase

2.2.3供試品溶液的制備 取樣品0.05 g，置于10m l量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.4 空白對照溶液的制備 取不含鹽酸阿糖胞苷的樣品，按“2.2.3”項下方法制成空白對照溶液。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 主成分含量測定的專屬性考察 分別取“2.2”項下的對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各10μl，分別注入UPLC儀，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，空白對照對鹽酸阿糖胞苷含量測定無干擾。

圖1 超高效液相色譜圖A.空白對照；B.對照品；C.供試品；1.尿嘧啶；2.鹽酸阿糖胞苷；3.尿苷；4.阿糖尿苷Fig 1 UPLC chromatogram sA.blank control；B.substance control；C.test sample；1.uracil；2. cytarabine hydrochloride；3.uridine hydrochloride；4.1-β-D-arabino furanosyl-uracil

2.3.2破壞性試驗（1）精密稱取樣品0.005 2 g，置于10m l量瓶中，加1mol/L鹽酸溶液1m l，室溫放置0.5 h，用1mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，加水稀釋至刻度，搖勻，備用；（2）精密稱取樣品0.005 5 g，置于10m l量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉1m l，室溫放置0.5 h，用1mol/L鹽酸溶液中和至中性，加水稀釋至刻度，搖勻，備用；（3）精密稱取樣品0.005 3 g，置于10m l量瓶中，加30%過氧化氫1m l，室溫放置0.5 h，加水稀釋至刻度，搖勻，備用；（4）精密稱取樣品0.005 2 g，于105℃干燥6 h，置于10m l量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用；（5）精密稱取樣品0.005 1 g，于（4 500±500）lx條件下照射8 h，置于10m l量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。精密量取上述5種溶液各10μl，分別注入UPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可見，本品在強酸、強堿、氧化、高溫、光照條件下，樣品均被破壞產生降解產物，所產生的降解產物在“2.1”項色譜條件下均能達到較好的分離。主峰與降解產物峰、各個雜質峰之間分離度均大于1.5。

圖2 破壞性試驗超高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.高溫破壞樣品；E.光照破壞樣品；1.鹽酸阿糖胞苷Fig 2 HPLC chromatogram s of treated testA.treated w ith acid；B.treated w ith alkali；C.treated w ith oxidation；D.treated w ith high temperature；E.treated w ith light；1.cytarabine hydrochloride

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下4種對照品貯備液各0.4、0.2、0.1、0.05m l，分別置于10m l量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件，分別取上述4種溶液10、5、3、2、1、0.5、0.3、0.1μl進樣，記錄色譜。以檢測質量濃度（x，μg/m l）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。

表2 回歸方程和線性范圍Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 檢測限和定量限

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜，以信噪比S/N＝3∶1計算鹽酸阿糖胞苷、尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷的檢測限，分別為3.00、1.008、3.018、2.868 ng；以信噪比S/N＝10∶1計算鹽酸阿糖胞苷、尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷的定量限，分別為10.00、3.024、5.03、4.78 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液10μl，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，結果，尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、鹽酸阿糖胞苷的RSD分別為0.08%、0.28%、0.28%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，分別于放置0、1、2、3、5、6、10、15 h時進樣測定。結果，尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷、鹽酸阿糖胞苷的RSD分別為0.07%、0.25%、0.37%、0.65%，表明15 h內對照品溶液穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20120401）適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算各成分含量。結果，尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷均未檢出，其它單雜（胞苷）的量平均為0.002%，RSD＝0.79%，表明本方法重復性良好。

2.9 有關物質加樣回收率試驗

精密稱取樣品（批號：20120401）共9份，每份約0.05 g，分別置于10m l量瓶中，精密加入“2.2.1”項下對照品溶液適量，加水稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 有關物質加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 3 The average recoveries of related substances（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取6批樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，按外標法以峰面積計算含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（%，n＝3）Tab 4 Results of content determ ination of sam p les（%，n＝3）

2.11 相對保留時間及相對校正因子的測定

2.12 樣品有關物質測定

精密稱取樣品50mg，置于10m l量瓶中，加水溶解并稀釋成每1m l含5mg的溶液，作為有關物質測定供試品溶液。取鹽酸阿糖胞苷對照品適量，精密稱定，用水溶解并定量稀釋制成每1m l含5μg的溶液作為有關物質測定對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件，取上述對照品溶液10μl，注入UPLC儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。再精密量取上述供試品溶液與對照品溶液各10μl，分別注入UPLC儀，測定并計算鹽酸阿糖胞苷的含量。結果，尿嘧啶峰、尿苷峰、阿糖尿苷峰對鹽酸阿糖胞苷峰的相對保留時間分別為0.53、1.14、1.55，尿嘧啶峰、尿苷峰、阿糖尿苷峰對鹽酸阿糖胞苷峰的相對校正因子分別為2.92、1.73、1.55；對鹽酸阿糖胞苷峰的相對保留時間約為0.38、0.43的色譜峰的相對校正因子均為1.72，其他雜質峰的相對校正因子均按1.1計算。結果見表5。

表5 樣品有關物質測定結果（%）Tab 5 Results of content determ ination of related substances in sam p les（%）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

色譜圖中可見尿嘧啶、尿苷、阿糖尿苷及鹽酸阿糖胞苷的最大吸收波長分別為259.9、262.1、263.3和272.5 nm，但由于鹽酸阿糖胞苷在254 nm波長處的吸收較強，既可以保證雜質的檢出，又能夠準確地測定主成分含量，故選擇254 nm作為本方法的檢測波長。

3.2 流動相的選擇

筆者研究發現，流動相中0.01mol/L磷酸氫二鈉和0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液的pH均為6.86，緩沖力較大，且較穩定。若將pH調至6.0或7.0，則需加入大量的稀酸或稀堿，不易控制，色譜峰易分叉。另外，由于本品黏度較大，重復多次進樣后色譜柱上殘留物不易洗脫干凈，柱壓不斷升高，因此在梯度洗脫主成分和主要雜質出峰后，增加了甲醇的比例，有利于洗脫色譜系統中殘留雜質，保持色譜條件的穩定。

3.3 色譜柱的選擇

筆者曾嘗試采用了3根不同品牌的C18色譜柱、兩臺不同型號的UPLC儀，分別在不同時間點采用本研究中的色譜條件進行測定。結果發現，Inertsil ODS-3 C18分離效果最好，無干擾，靈敏度高，且峰形較好。

3.4 樣品的穩定性

在破壞性試驗中均檢出了尿嘧啶和尿苷，加速試驗和長期試驗中均檢出了阿糖尿苷。鹽酸阿糖胞苷對溫度較敏感，可在放置過程中降解產生阿糖尿苷。因此，在貯藏時應注意溫度對樣品質量的影響。

綜上所述，本方法準確、靈敏度高、專屬性強、重復性好，可作為鹽酸阿糖胞苷原料藥的質量控制方法。

[1] 李莉霞，唐躍年.阿糖胞苷抗白血病藥理作用及耐藥機制的研究進展[J].中國藥房，2006，17（19）：1 506.

[2]British Pharmacopoeia Comm ission.BP2013[S].2012：631.

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[5]左英熹，李良，盧煒，等.高效液相色譜法測定體內脫氧核糖核酸結合的阿糖胞苷濃度[J].中國醫院藥學雜志，2008，28（9）：718.

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[8]林煥澤，藍忠，楊華，等.反相高效液相色譜法測定注射用鹽酸阿糖胞苷的有關物質[J].中國藥業，2009，18（15）：27.

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Simultaneous Determ ination of Cytarabine Hydrochloride and Related Substances by UPLC

HAILi-ping1，YANG Dong-jing2，WANG Zhi-yuan3，WANG Xue-qin4（1.First Outpatient Department，Departments Directly under Henan Province，Zhengzhou 450003，China；2.Medical College of Henan University，Henan Kaifeng 475001，China；3.Pharmaceutical College of Henan University，Henan Kaifeng 475001，China；4.Henan Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of cytarabine hydrochloride and related substance.METHODS：UPLCmethod was adopted.The determination was performed on Inertsil ODS-3 C18column w ithmobile phase consisted of phosphate buffer-methanol（gradient elution）at the flow rate of 0.8 m l/min；the detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 40℃.The sample size was 10μl.RESULTS：The liner ranges were 0.100 8-20.16μg/m l for uracil（r＝0.999 9），0.1-20.12μg/m l for uridine（r＝0.999 8），0.095 6-19.12μg/m l for 1-β-D-arabino furanosyl-uracil（r＝0.999 9）and 0.1-20.004μg/m l for cytarabine hydrochloride（r＝0.999 9），respectively.RSD of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 0.79%；average recoveries of uracil，w ridine and 1-β-D-arabino furanosyl-uracil were 103.8%（RSD＝2.44%，n＝9），102.2%（RSD＝2.69%，n＝9）and 99.7%（RSD＝3.16%，n＝9）.CONCLUSIONS：Themethod is accurate，sensitive，specific and reproducible，and can be used for the quality control of cytarabine hydrochloride.

Cytarabine hydrochloride；Uracil；Uridine；1-β-D-arabino furanosyl-uracil；UPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2014）12-1137-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.28

2013-12-14

2014-1-13）

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