基于Keap1-Nrf2-ARE探討強直性脊柱炎患者心功能降低的機制①

齊亞軍 劉 健 鄭 力 萬 磊 曹云祥 孫 玥 王 芳(安徽中醫藥大學研究生部，合肥230038)

基于Keap1-Nrf2-ARE探討強直性脊柱炎患者心功能降低的機制①

齊亞軍 劉 健②鄭 力③萬 磊②曹云祥②孫 玥 王 芳(安徽中醫藥大學研究生部，合肥230038)

目的:基于Keap1-Nrf2-ARE通路探討強直性脊柱炎(AS)患者心功能降低的機制。方法:隨機選取140例AS患者作為研究組，并抽取60例健康人作為正常對照組;采用多普勒超聲心動圖(UCG)檢測兩組心功能參數[E峰、A峰、E/A比值、左心房舒張期內徑(LADd)、左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室射血分數(EF)、每搏輸出量(SV)];采用ELISA法檢測兩組血清中通路蛋白[Keap1樣ECH相關蛋白l(Keap1)、核因子NF-E2相關因子(Nrf2)]、氧化應激指標[丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(TAOC)]和細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10)含量;采用魏氏法檢測炎性指標血沉(ESR);采用日立7060型全自動生化分析儀檢測C反應蛋白(CRP)、免疫球蛋白。結果:(1)與正常對照組相比，AS活動期心功能參數(E峰、EF、E/A 值)、抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05);心功能參數 A 峰、通路蛋白(Keap1、Nrf2 值)、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(ESR、CRP)值顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)。(2)與正常對照組相比，AS穩定期心功能參數[E峰、E/A值]、抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05);心功能參數 A峰、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(TNF-α)、炎性指標(ESR、CRP)值顯著升高(P ＜0.01 或 P ＜0.05)。(3)與 AS穩定期相比，AS活動期心功能參數(E峰、EF、E/A值)、抗氧化指標(SOD、TAOC)、細胞因子(IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或P ＜0.05);通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指標(ESR、CRP)、AS臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值顯著升高(P ＜0.01 或 P ＜0.05)。(4)與 AS 患者 Keap1、Nrf2正常組比較，Keap1、Nrf2異常組心功能參數A峰顯著升高，E峰、E/A值顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。(5)相關性分析顯示，心功能參數E峰與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關，與通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(ESR、CRP)、AS 臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、免疫球蛋白 G(IgG)、病程呈負相關;心功能參數 A峰與通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS臨床評價指標、心悸癥狀呈正相關，與通路蛋白 Keap1、抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關;心功能參數 E/A比值與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關，與氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(TNF-α)、AS臨床評價指標、病程呈負相關;心功能參數EF與病程呈負相關;心功能參數FS與通路蛋白Keap1呈負相關(P＜0.05)。結論:33.56%的AS患者存在心功能降低，表現為心功能參數E峰、E/A值顯著降低，A峰顯著升高;心功能參數E峰、E/A值均與抗氧化指標、抑炎細胞因子呈正相關，與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標、致炎細胞因子、炎癥指標呈負相關;而心功能參數A峰與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標、致炎細胞因子呈正相關，與抗氧化指標、抑炎細胞因子呈負相關。Keap1、Nrf2表達上升，Keap1-Nrf2-ARE信號通路活化后，機體抗氧化能力下降，促使細胞因子失衡、炎癥指標升高，導致免疫復合物異常沉積增多，在引起AS發病的同時出現心功能降低。

強直性脊柱炎;心功能;Keap1;Nrf2;氧化應激

強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性、進行性、自身免疫性疾病，其病變并非局限于關節，多引起關節以外的結締組織的病變。心血管系統因富含豐富的結締組織與血管，很容易受累。前瞻性研究表明AS相關的心血管疾病的發生率為10% ～30%[1]，顯著高于普通人心血管疾病的發生率[2]。一般認為其發病與感染、遺傳和免疫有關，但確切發病機制至今尚未明確。近年來，研究表明氧化應激(Oxidative stress，OS)可能參與AS相關的心血管疾病病理過程，在其發生、發展中起重要作用。

研究發現，核因子 NF-E2相關因子(Nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)通過與抗氧化反應元件(Antioxidant response element，ARE)相互作用調節編碼抗氧化蛋白，是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路[3]。Keap1樣ECH相關蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)-Nrf2/ARE作為機體內有效的抗氧化調節通路，對于防御、減輕氧化應激對人體的危害起著舉足輕重的作用[4]。

Nrf2廣泛存在于多種組織和細胞中，在調節氧化應激反應中起重要作用。正常情況下，Keap1將Nrf2以二聚體形式錨定于胞漿，促使胞漿內Nrf2持續泛素化并被蛋白酶不斷降解，從而抑制Nrf2激活[5]。應激狀態下，活性氧、活性氮和內外源性電子激活劑可氧化Keap1上的巰基或磷酸化Nrf2分子中的絲氨酸和蘇氨酸殘基，從而改變Keap1或Nrf2空間構象，抑制Keap1活性，導致Nrf2與Keap1分離，向細胞核內轉移;在核內，Nrf2與小分子Maf蛋白結合形成二聚體，然后再與ARE結合，啟動下游抗氧化酶基因及II相解毒酶基因轉錄，從而調節細胞氧化還原狀態，抵抗氧化應激和其他毒性損傷，實現其抗氧化和解毒作用[6-8]。Keap1-Nrf2-ARE信號通路的活化，是機體對環境毒物的一種應激防御反應能力的體現。

國外諸多醫家研究表明氧化水平升高和抗氧化能力下降可能與AS的發病有關，但AS關節外病變心功能的變化是否與氧化應激紊亂有關?迄今為止未見相關文獻報道[9-20]。Keap1-Nrf2/ARE作為機體內最為重要的內源性抗氧化應激通路，在AS心功能損傷中扮演著何種角色?尚不清楚。故本次研究我們先假設Keap1-Nrf2/ARE通路活化是AS患者心功能降低的作用機制(簡明機制示意圖請見圖1)，然后通過觀察AS患者心功能Keap1-Nrf2/ARE的變化，并將心功能變化與Keap1-Nrf2/ARE通路指標進行相關性分析，旨在說明Keap1-Nrf2/ARE通路在AS患者心功能降低中的作用，探討心功能降低的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2012年5月-2013年6月安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科住院病人中，隨機選取140例AS患者，其中男112例，女28例，男:女為4∶1，年齡18 ～60 歲，平均年齡(30.8 ±9.7)歲;病程0.5～28 年，平均病程(9.5 ±7.3)年。所有患者均符合依據1984年修訂的強直性脊柱炎紐約診斷標準并參考2009年3月ASAS發布的中軸型SPA分類標準[21，22]，且排除原發性心血管疾病(如冠心病、先天性心臟病等)。另設60例正常對照(NC)組，男48 例，女12 例，男∶女為4∶1，年齡21～52 歲，平均年齡為(28.5±10.4)歲，均來自安徽中醫藥大

學第一附屬醫院體檢中心，經體檢和免疫學檢查排除自身免疫性疾病，均為身體健康、無明顯器質性疾病者。兩組間年齡、性別無統計學差異。本研究方案已通過我院倫理審查委員會審批，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標及方法

1.2.1 心功能測定 應用美國GE VIVID 7超聲診斷儀，探頭頻率為2～5 mHz。具體操作:患者取左側臥位，對心臟進行常規檢查，觀察瓣膜結構、活動度、異常血流和頻譜信號，測量二尖瓣口舒張早期峰值流速(E)、舒張晚期峰值流速(A)、舒張早期峰值流速/舒張晚期峰值流速(E/A)、左心房舒張期內徑(LADd)、左心室舒張末期內徑(LVDd)，采用改良simpson法測量左心室射血分數(EF)、每搏輸出量(SV)、左心室短軸縮短率(FS)。所有指標均連續測量3次，取平均值，超聲檢查的操作及分析均由高年資的專業超聲醫師完成。

1.2.2 氧化應激指標測定 留取患者血清10 ml，3 000 r/min離心15 min，分離后進行4等份分裝，-80℃冷凍保存統一檢測。所有指標均參照試劑盒說明書進行操作。參照標準曲線計算標本相應指標的測定值。采用酶聯免疫分析法(ELISA法)檢測AS患者和正常對照組血清中通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化應激指標[丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、總抗氧化能力(TAOC)]、細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10)含量。Keap1、Nrf2 試劑盒購自美國 Millipore公司;MDA、ROS、RNS、SOD、CAT、TAOC試劑盒購自南京建成生物工程研究所;IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 試劑盒購自英國伯明翰公司。

圖1 AS心功能降低假說Fig.1 Hypothesis of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis

1.2.3 實驗室指標測定 所有被選對象均于清晨空腹時靜脈采血10 ml，采集后標本立即送往安徽中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心檢測，檢測指標主要有:ESR、hs-CRP、IgG、IgA、IgM。檢測方法:ESR用魏氏法，以 mm/h表示;hs-CRP、IgG、IgA、IgM 用日立7060型全自動生化分析儀進行測定，以mg/L表示。

1.2.4 主要癥狀量化評分標準 參照衛生部《新藥(中藥)臨床研究指導原則》[23]，將具體的心功能癥狀換算成積分值。

1.2.5 AS臨床評價指標評分[24]采用視覺模擬評分(Visual analog scales，VAS)、Bath強直脊柱炎疾病活動指數(Bath ankylosing spondylitis disease active index，BASDAI)、Bath強直脊柱炎功能指數(Bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI)、Bath強直脊柱炎計量指數(Bath ankylosing spondylitis metrology index，BASMI)、Bath 強直性脊柱炎總體指數(Bath ankylosing spondylitis global index，BAS-G)對AS患者進行評分(0～10分)，分值越高，表示病情越重。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件包對數據進行統計學處理，為連續性變量的實驗數據用x-±s表示，樣本均采用Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗;計量資料采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗;而采用Spearman軟件進行相關性分析。當P＜0.05或P＜0.01時，才認為有統計學意義。

2 結果

2.1 AS組與NC組心功能變化檢測結果 140例AS患者與60例NC組多普勒超聲異常率比較得知，AS組多普勒超聲心功能變化檢測結果異常率為33.56%，NC組異常率為8.33%。見表1。

表1AS組與NC組心功能異常率比較(n，%)Tab.1 Comparison of echocardiographic abnormality between AS group and NC group(n，%)

2.2 AS患者和NC組心功能參數、氧化應激指標、細胞因子、炎癥指標的比較 與NC組相比，AS活動期心功能參數(E峰、EF、E/A值)、抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);心功能參數A峰、通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(ESR、CRP)值顯著升高 (P＜0.01或P＜0.05)。與NC組相比，AS穩定期心功能參數(E峰、E/A值)、抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);心功能參數A峰、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(TNF-α)、炎性指標(ESR、CRP)值顯著升高(P＜0.01或 P＜0.05)。與AS穩定期相比，AS活動期心功能參數(E 峰、EF、E/A 值)、抗氧化指標(SOD、TAOC)、細胞因子(IL-10)值均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05);通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指標(ESR、CRP)、AS 臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值顯著升高(P＜0.01或 P＜0.05)。見表2。

表2 AS患者和NC組心功能參數、氧化應激指標等指標的比較( ± s)Tab.2 Comparison of indicators such as oxidative stress andcardiacfunction parametersbetween AS group and NC group(±s)

表2 AS患者和NC組心功能參數、氧化應激指標等指標的比較( ± s)Tab.2 Comparison of indicators such as oxidative stress andcardiacfunction parametersbetween AS group and NC group(±s)

Note:Vs NC group，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;vs NC group，3)P ＜0.01，4)P ＜0.05;vs AS in stable stage group，5)P ＜0.01，6)P ＜ 0.05.LADd:Left artrial diastolic diameter;LVDd:Left ventricular diastolic diameter;LVPWTd: Left ventricular posterior wall thickness at end-diastole;FS:Fraction shortening;EF:Ejection fraction;SV:Stroke volume;E peak:early diastolic E;A peak:late diastolic A.

Index NC group(60) AS in active stage(98) AS in stable stage(42) LADd(mm) 5.26 ±1.05 25.67 ±2.15 28.26 ±3.51 27.18 ±2.94 LVDd(mm) 46.17 ±1.34 44.69 ±1.84 45.23 ±1.46 LVPWTd(mm) 8.67 ±0.65 8.47 ±0.64 8.53 ±0.78 E peak(m/s) 1.25 ±0.32 0.92 ±0.121)5) 1.13 ±0.173) A peak(m/s) 0.83 ±0.18 1.09 ±0.281) 1.01 ±0.213) E peak/A peak 1.66 ±0.33 1.18 ±0.241)5) 1.31 ±0.363) SV(ml) 68.10 ±9.01 67.11 ±8.96 67.57 ±9.12 EF 66.01 ±5.87 63.34 ±3.221)5) 65.42 ±3.91 Keap1(ng/ml) 4.82 ±3.26 7.30 ±5.311)5) 4.98 ±3.34 Nrf2(ng/ml) 6.01 ±4.02 8.39 ±3.432)6) 6.78 ±4.69 ROS(ng/ml) 2.77 ±0.09 3.81 ±0.441)6) 3.26 ±0.254) RNS(U/ml) 97.82 ±6.83 133.12 ±24.231)5) 106.52 ±10.684) MDA(nmol/ml)10.65 ±6.11 34.36 ±19.711)5) 21.23 ±11.422) SOD(U/ml) 163.73 ±46.52 130.23 ±36.292)6) 142.68 ±39.864) CAT(ku/L) 301.48 ±130.46 226.57 ±122.931)251.33 ±126.524)6) TAOC(U/ml) 3.13 ±0.54 2.11 ±0.171)6) 2.69 ±0.464) IL-1β(pg/ml) 2.58 ±1.72 3.76 ±2.831)5) 2.87 ±2.25 TNF-α(ng/L) 19.76 ±17.8 280.25 ±167.681)5) 89.93 ±25.243) IL-4(ng/L) 425.61 ±246.18 355.65 ±262.132) 387.73 ±233.644) IL-10(ng/L)171.52 ±32.24 101.67 ±14.561)6) 138.45 ±27.464) ESR(mm/h) 9.21 ±3.53 32.27 ±12.511)5) 11.37 ±3.69 CRP(mg/L) 1.96 ±0.85 22.65 ±2.731)5) 5.48 ±0.74 VAS 0 8.34 ±2.585) 5.12 ±1.26 BASDAI 0 7.45 ±1.965) 5.31 ±1.68 BASFI 0 6.84 ±1.885) 4.97 ±1.62 BASMI 0 8.59 ±1.765) 5.48 ±1.59 BAS-G 0 8.12 ±1.165)

2.3 AS患者外周血Keap1、Nrf2異常者心功能變化 以60例正常對照組外周血Keap1、Nrf2數值統計正常值區間，Keap1(1.99 ～12.61 ng/ml)、Nrf2 (2.01 ～10.03 ng/ml)，篩選出 AS 患者 Keap1、Nrf2異常組別。與Keap1正常組比較，Keap1異常組心功能參數 LADd、A峰升高，E峰、E/A值降低;與Nrf2正常組比較，Nrf2異常組心功能參數A峰升高，E 峰、E/A 值、EF降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)。與Nrf2異常組比較，Keap1異常組心功能參數A峰升高，E峰、E/A值降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表3。

2.4 AS患者外周血 Keap1和 Nrf2表達與氧化應激指標、細胞因子、心功能癥狀等指標的相關分析

Spearman相關分析結果顯示，AS患者外周血通路蛋白Keap1表達與氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子 (IL-1β、TNF-α)、疾病活動性指標 (ESR、CRP)、AS 臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值、心悸癥狀呈正相關(P ＜0.05 或P ＜0.01);與抗氧化指標(SOD、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關(P ＜0.05或 P ＜0.01)。AS患者外周血Nrf2表達與抗氧化指標(SOD、CAT)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關(P＜0.05或 P＜0.01);與氧化指標(ROS、RNS、MDA)、AS 臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI)值、心悸癥狀呈正相關(P ＜0.05或P ＜0.01)。見表4。

表3 AS患者外周血Keap1、Nrf2異常者心功能參數變化(±s)Tab.3 Change of cardiac function parameters in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(±s)

表3 AS患者外周血Keap1、Nrf2異常者心功能參數變化(±s)Tab.3 Change of cardiac function parameters in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(±s)

Note:Vs NC group of the same group，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;vs abnormal Nrf2 group，3)P ＜0.01，4)P ＜0.05.

Cardiac function parameters Keap1 Nrf2 Abnormal (n=56) Normal (n=84) Abnormal (n=51) Normal (n=89) LADd(mm) 28.78 ±3.812) 66.13 ±5.73 25.43 ±2.21 26.02 ±1.83 25.69 ±2.11 LVDd(mm) 45.5 ±12.07 45.96 ±1.5845.91 ±1.5846.15 ±1.38 LVPWTd(mm) 8.56 ±0.65 8.53 ±0.76 8.58 ±0.76 8.62 ±0.66 E peak(m/s)1.03 ± 0.311)3)1.21 ± 0.38 0.98 ±0.231)1.23 ± 0.35 A peak(m/s)0.98 ±0.172)3)0.86 ±0.13 1.07 ±0.261)0.83 ±0.18 E peak/A peak 1.41 ±0.411)4)1.63 ±0.37 1.39 ±0.361)1.65 ±0.32 SV(ml) 68.15 ±9.78 68.23 ±8.9568.13 ±8.9168.19 ±8.87 EF(%) 65.85 ±5.89 66.01 ±5.87 64.08 ±5.152)

表4 AS患者外周血Keap1和Nrf2表達與氧化應激指標、細胞因子、心功能癥狀等指標的相關分析(r，n=140)Tab.4 Correlation analysis of the Keap1 and Nrf2 expression with related indicatorssuch asoxidative stress，cytokines，symptoms of cardiac function in AS patients(r，n=140)

表5 AS患者心功能參數與氧化應激、心功能癥狀等指標的相關分析(r，n=140)Tab.5 Correlation analysis of cardiac function parameters with related indicators such as oxidative stress，cytokines，symptoms of cardiac function in AS patients(r，n=140)

2.5 AS患者心功能參數與氧化應激指標、癥狀體征積分等指標的相關分析 Spearman相關性分析顯示，心功能參數E峰與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關，與通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS 臨床評價指標(VAS、BAS-DAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、炎 性 指 標 (ESR、CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、病程呈負相關;心功能參數A峰與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS 臨床評價指標、心悸癥狀呈正相關，與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關;心功能參數 E/A比值與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關，與通路蛋白 Keap1、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(TNF-α)、AS臨床評價指標、病程呈負相關;心功能參數EF與心悸癥狀、病程呈負相關;心功能參數FS與通路蛋白Keap1呈負相關(P＜0.05)。見表5。

3 討論

強直性脊柱炎是以骶髂關節和脊柱中軸關節慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，臨床上若延誤診治，易引起關節以外的結締組織的病變[25]。心血管系統因富含豐富的結締組織與血管，因此很容易受累。自由基是機體內很強的氧化反應能力的分子、離子、原子或原子團，當自由基過度產生或機體的抗氧化防御體系功能受損時，機體將處于氧化應激狀態，從而導致組織細胞損傷[26，27]。

本研究結果顯示，33.56%的AS患者存在心功能降低，與NC組相比，AS患者心功能參數(E峰、E/A、EF)值均顯著降低(P＜0.01);A峰顯著升高(P＜0.01)。與NC組相比，AS患者血清中SOD、CAT、TAOC值均顯著降低(P ＜0.01或 P ＜0.05)，ROS、RNS、MDA 值顯著升高(P ＜0.01或 P ＜0.05)。ROS、RNS、MDA 是反映機體氧化水平的關鍵指標;而SOD、CAT、TAOC是反映機體抗氧化水平的關鍵指標;本研究發現心功能降低的AS患者存在氧化應激紊亂，處于氧化水平升高和抗氧化能力明顯下降的狀態。與NC組相比，AS患者細胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指標(ESR、CRP)值顯著升高(P ＜0.01)，細胞因子(IL-4、IL-10)值顯著降低(P＜0.01或 P ＜0.05)。與 AS穩定期相比，AS活動期臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值顯著升高(P ＜0.01或 P ＜0.05)。IL-1β、TNF-α 屬于致炎細胞因子[28]，而 IL-4、IL-10 屬于抗炎細胞因子，ESR、CRP、VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G可反映疾病的活動程度和嚴重程度;本研究發現心功能降低的AS患者處于疾病活動狀態且存在細胞因子失衡，炎性細胞因子含量明顯升高，與NC組相比，心功能降低的AS患者 Keap1、Nrf2表達上升;這表明心功能降低的AS患者存在Keap1-Nrf2/ARE通路的活化。

圖2 AS心功能降低機制Fig.2 Mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis

為進一步驗證Keap1-Nrf2/ARE通路在AS患者心功能降低中的影響，本研究發現，與AS患者外周血Keap1、Nrf2正常組比較，Keap1、Nrf2異常組心功能參數E峰、E/A、EF值均顯著降低;A峰顯著升高，提示AS患者外周血Keap1、Nrf2升高會直接或間接導致心功能降低。

本研究通過相關分析得知，心功能降低的AS患者心功能參數E峰與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、抑炎細胞因子(IL-4、IL-10)呈正相關，而與通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指標(ESR、CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、病程呈負相關;心功能參數A峰與通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指標(ROS、RNS、MDA)、促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α)、心悸呈正相關，與抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)、抑炎細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關。而AS患者外周血通路蛋白 Keap1表達與氧化指標(ROS、RNS、MDA)、細胞因子(IL-1β、TNF-α)、疾病活動性指標(ESR、CRP)、AS 臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、心悸癥狀呈正相關;與抗氧化指標(SOD、TAOC)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關。AS患者外周血 Nrf2表達與抗氧化指標(SOD、CAT)、細胞因子(IL-4、IL-10)呈負相關;與氧化指標(ROS、RNS、MDA)、AS 臨床評價指標(VAS、BASDAI、BASFI)、心悸癥狀呈正相關。這提示Keap1、Nrf2的水平與AS疾病活動狀態、氧化應激狀態、細胞因子平衡、心功能參數明顯相關。當體內(ROS、RNS)等氧化指標含量升高時，Keap1、Nrf2表達上升，Keap1-Nrf2-ARE信號通路活化，抗氧化指標(SOD、CAT、TAOC)含量下降，機體抗氧化能力降低，促使細胞因子失衡(IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子含量升高，而IL-4、IL-10等抑炎細胞因子含量降低)ESR、CRP等疾病活動性指標升高，導致免疫復合物異常沉積增多，促使AS發病，當免疫復合物異常沉積于心組織時，致使心組織或器官受到損傷或破壞，UCG檢測則提示反映心室舒張功能的指標E峰和E/A比值下降，A峰升高;反映心室收縮功能的指標射血分數EF降低，臨床上則出現心悸等心功能降低癥狀。

本研究結果與本研究前假說基本一致(見圖2)，鑒于以上研究結果，我們可以認為氧化應激可能參與了AS心功能降低的發生與發展，Keap1-Nrf2-ARE信號通路的活化可能是心功能降低的機制。

[1]Roldan CA.Valvular and coronary heart disease in systemic in flammatory diseases:systemic disorders in heart disease[J].Heart，2008，94:1089-1101.

[2]Peters MJ，Visman I，Nielen MM，et al.Ankylosing spondylitis:a risk factor for myocardial infarction?[J].Ann Rheum Dis，2010，69(3):579-581.

[3]Baba K，Morimoto H，Imaoka S，et al.Seven in absentia homolog 2 (Siah2)protein is a regulator of NF-E2-related factor 2(Nrf2)[J].J Biol Chem，2013，288(25):18393-18405.

[4]Taguchi，Keiko，Fujikawa，et al.Keap1 degradation by autophagy for the maintenance of redox homeostasis[J].Proce National Acad Sci USA，2012，109(34):13561-13566.

[5]Wang H，Liu K，Geng M，et al.RXRα inhibits the NRF2-ARE signaling pathway through a direct interaction with the Neh7 domain of NRF2[J].Cancer Res，2013，73(10):3097-3108.

[6]Alfieri A，Srivastava S，Siow RC，et al.Targeting the Nrf2-Keap1 antioxidant defence pathway for neurovascular protection in stroke[J].J Physio，2011，589(17):4125-4136.

[7]Niture SK，Kaspar JW，Shen J，et al.Nrf2 signaling and cell survival[J].Toxicol Appl Pharm，2010，244(1):37-42.

[8]Boutten A，Goven D，Artaud-Macari E，et al.NRF2 targeting:a promising therapeutic strategy in chronic obstructive pulmonary disease[J].Trends Mol Med，2011，17(7):363-371.

[9]Murat Karkucak，Erhan Capkin，Ahmet alver，et al.The effect of anti-TNF agent on oxidation status in patients with ankylosing spondylitis[J].Clin Rheumat，2010，29(3):303-307.

[10]Mehmet Karakoc，Ozlem Altindag，Huseyin Keles，et al.Serum oxidative-antioxidative status in patients with ankylosing spondilitis[J].Rheuma Inter，2007，27(12):1131-1134.

[11]劉 磊，劉 健，馮云霞，等.強直性脊柱炎患者血清超氧化物歧化酶的變化及相關因素分析[J].中國臨床保健雜志，2012，15(5):478-481.

[12]Olama SM，Elarman MM.Evaluation of paraoxonase and arylesterase activities in Egyptian patients with ankylosing spondylitis[J].Rheumatol Int，2013，33(6):1487-1494.

[13]Naziroglu，Mustafa，Akkus，et al.Levels of lipid peroxidation and antioxidant vitamins in plasma and erythrocytes of patients with ankylosing spondylitis[J].Clin Biochem，2011，44(17): 1412-1415.

[14]Il′in MV，Mal′tseva PA，Rosanov DV，et al.Changes in oxidative stress and apoptosis parameters of neutrophils in rheumatoid diseases[J].Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，2012，1(1): 89-92.

[15]Iervolino S，Di Minno MN，Peluso R，et al.Predictors of early minimal disease activity in patients with psoriatic arthritis treated with tumor necrosis factor-α blockers[J].J Rheumatol，2012，39 (3):568-573.

[16]Stanek A，Cie s′lar G，Romuk E，et al.Decrease in antioxidant status of plasma and erythrocytes from patients with ankylosing spondylitis[J].Clin Biochem，2010，43(6):566-570.

[17]Erdem FH，Karatay S，Yildirim K，et al.Evaluation of serum paraoxonase and arylesterase activities in ankylosing spondylitis patients[J].Clinics，2010，65(2):175-179.

[18]Stanek A，Cie s′lar G，Romuk E，et al.Decrease in antioxidant status of plasma and erythrocytes from patients with ankylosing spondylitis[J].Clin Biochem，2010，43(6):566-570.

[19]Akyuz A，Kiris A，Ak E，et al.The effect of anti-TNF agent on oxidation status in patients with ankylosing spondylitis[J].Clin Rheumatol，2010，29(3):303-307.

[20]Kozaci LD，Sari I，Alacacioglu A，et al.Evaluation of inflammation and oxidative stress in ankylosing spondylitis:a role for macrophage migration inhibitory factor[J].Mod Rheumatol，2010，20 (1):34-39.

[21] 陸再英主編.內科學[M].第7版.北京:人民衛生出版社，2008:867-868.

[22]中華醫學會風濕病學分會.強直性脊柱炎診斷及治療指南[J].中華風濕病學雜志，2010，14(8):557-559.

[23] 鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則(試行)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2002:123.

[24]Bidad K，Fallahi S，Mahmoudi M，et al.Evaluation of the Iranian versions of the bath ankylos-ing spondylitis disease activity index (BASDAI)，the bath ankylosing spondylitis functional index (BASFI)and the Patient Acceptable Symptom State(PASS)in patients with ankylosing spondylitis[J].Rheumatol Inter，2012，32(11):3613-3618.

[25]王新衛，林智明，廖澤濤，等.IL-23與IL-17在強直性脊柱炎患者中表達的初步研究[J].中國免疫學雜志，2009，25(3): 266-270.

[26]Yazici C，K?se K，Calis M，et al.Protein oxidation status in patientswith ankylosing spondylitis[J].Rheumatology，2004，43 (10):1235-1239.

[27]Feijoo M，Tunez I，Ruiz A，et al.Oxidative stress biomarkers as indicator of chronic inflammatory joint diseases stage[J].Reumatol Clin，2010，6(2):91-94.

[28]丁 紅，閔 睿，王宗謙.IL-1β對大鼠腹膜間皮細胞葡萄糖轉運蛋白1表達的影響[J].中國免疫學雜志，2011，27(5): 400-402.

[收稿2013-09-25 修回2013-11-20]

(編輯 許四平)

Exploring mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis based on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway

QI Ya-Jun，LIU Jian，ZHENG Li，WAN Lei，CAO Yun-Xiang，SUN Yue，WANG Fang.Graduate Department of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China

Objective:To explore the mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis based on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway.MethodsExperiment group included 140 ankylosing spondylitis(AS)patients and control group included 60 healthy individuals.Echocardiography(UCG)was used to detect cardiac function parameters.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was adopted to determine serum proteins，oxidative stress indicators and cytokines.Erythrocyte sedimentation and plasma C reactive protein，immunoglobulin were detected with Westergren method and Hitachi 7060 automatic biochemical analyzer respectively.Results(1)Compared with the normal control group，character of AS group in active stage:cardiac function parameters(E peak，EF，E/A)，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)decreased(P ＜ 0.01 or P ＜ 0.05 all).A peak，Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)increased(P ＜ 0.01 or P ＜0.05 all).(2)Compared with the normal control group，character of AS group in stable stage:cardiac function parameters(E peak，E/A)，Keap1，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)decreased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).A peak，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)increased(P ＜ 0.01 or P ＜0.05 all).(3)Compared with AS group in stable stage，character of AS group in active stage:cardiac function parameters(E peak，EF，E/ A)，antioxidant indicators(SOD，TAOC)，cytokines(IL-10)decreased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)，clinical evaluation indicators(VAS，BASDAI，BASFI，BASMI，BAS-G)increased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).(4)Compared with AS patients with normal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood，A peak increased while E peak and E/A decreased in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(P ＜0.01 or P ＜0.05).(5)Spearman correlation analysis showed:AS parameters of cardiac function in patients with E peak and antioxidant indicators (SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)showed significant positive correlation.E peak and Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)，clinical evaluation indicators(VAS，BASDAI，BASFI，BASMI，BAS-G)，IgG，course of the disease were significantly negatively correlated.A peak and Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，clinical evaluation indicators，Palpitation showed significant positive correlation.A peak and antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)were significantly negatively correlated.E/A and Keap1，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)showed significant positive correlation.E/A and oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(TNF-α)，cxcinical evaluation indicators，course of the disease were significantly negatively correlated.EF and course of the disease were significantly negatively correlated.FS and Keap1 showed significant negative correlation.ConclusionCardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis is 33.56%.The characteristic performance is that E peak，E/A decreased while A peak increased.E peak，E/A and antioxidant indicators，anti-inflammatory cytokines show significant positive correlation.E peak，E/ A and Keap1，oxidation index，pro-inflammatory cytokines，inflammatory indicators are significantly negatively correlated.A peak and Keap1，oxidation index，pro-inflammatory cytokines show significant positive correlation.A peak and antioxidant indicators，anti-inflammatory cytokines are significantly negatively correlated.The rising of Keap1 expression cause activate the Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway.After the signaling pathway is activated，the body′s antioxidant ability decreased，pro-inflammatory cytokines imbalanced，inflammation index increased.When the body is long be in unbalance condition，the number of abnormal immune complex deposition increased.In the end，the result is that AS is caused and cardiac function is decreased.

Ankylosing Spondylitis;Cardiac function;Keap1;Nrf2;Oxidative stress

R593.23

A

1000-484X(2014)05-0654-08

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.019

①本文受國家自然科學基金(No.81173211)、國家中醫藥重點學科中醫痹病學建設項目(國中醫藥發[2009]30號)、安徽省科技廳科研計劃項目(09020304046)、安徽省衛生廳中醫藥科研項目(2009ZY05)、安徽現代中醫內科應用基礎與開發研究省級實驗室建設項目(科條[2008]150號)、安徽中醫學院科技創新團隊項目(2010TD005)資助。

②安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕免疫科，合肥230031。

③Department of Radiation Biology，City of Hope National Medical Center and Beckman Research Institute，Duarte，CA91010，USA。

齊亞軍(1987年-)，男，主要從事中醫藥防治風濕病的研究。

及指導教師:劉 健(1964年-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事中醫藥防治風濕病的研究，E-mail:liujianahzy@126.com。