斑馬魚模型在中醫藥研究中的應用※

邢學鋒 馬欽海 徐成賀 許文學

（南方醫科大學中醫藥學院中藥藥劑實驗室，廣州 510515）

近年來，隨著中醫藥事業的迅猛發展，國內外對中藥的研究也不斷的深入。中藥是多成分、多靶點的復雜體系，其藥效物質是其發揮臨床治療作用的基礎，中藥藥效篩選和評價的新技術和新方法的引進已成為中醫藥學者關注的重點。目前，模式生物斑馬魚的使用正逐漸拓展到生命體多個系統，并已應用于小分子化合物的大規模新藥篩選。這對中藥有效成分的篩選、作用機制的闡明、體內代謝的過程等具有巨大的促進作用。總結國內外研究發現，目前斑馬魚在中藥中的應用主要集中在中藥代謝研究、毒理研究和重大疾病中藥成分活性篩選等幾方面，本文將就斑馬魚在篩選模型、現代生物技術與傳統中醫中藥研究相結合的新型模式等應用情況進行探討，以期有益于中醫藥事業現代研究的發展。

1 斑馬魚的生物學特性

斑馬魚 (zebrafish)又名藍條魚、花條魚，是輻鰭亞綱 (Actinopterygii)鯉科 (Cyprinidae)短擔尼魚屬(Danio)的一種熱帶淡水魚[1]。斑馬魚繁殖能力強，胚胎發育迅速，幼魚體長非常小，作為藥物篩選模型具有以下優點：篩選周期短、準確率高，胚胎透明、容易觀察，樣品用量少、用藥簡單、活體動物實驗，與人類有高度相關性等優點，因而利用斑馬魚模型篩選出的成分其活性相對比較準確。

另外，此模型克服了只能觀察化合物對某一特定生理過程的效果，無法從整體水平直觀地評估藥物的治療作用、毒性作用、不良反應等體外細胞和化學篩選模型的缺點。活體動物的整體器官與表型篩選可觀察化合物對復雜生命過程的影響[2]。

2 斑馬魚在中藥毒理學方面的研究

從20世紀70年代末期，國外開始運用斑馬魚進行化合物的毒性、毒理研究[3]，斑馬魚現在已經被廣泛地用于環境、藥物、病理等毒理學領域的研究中，并顯現出很多獨特的優勢[4]，目前其在藥物早期毒性篩選方面最主要是運用在胚胎發育毒性、神經毒性、心臟毒性等方面的研究，且斑馬魚具有重復性好、預測性高等的體內篩選藥物毒性的模式動物的獨特優點，使其在新藥研發方面具有重要價值，而在中藥毒性篩選方面，主要集中在斑馬魚的胚胎、心臟的毒性影響的研究。

通過對研究不同中藥，如飛機草[5]，雷公藤[6]，兩面針[7-8]，莪術[9]、甘遂[10]秋水仙堿[11]等對斑馬魚胚胎心臟毒性、腦毒性等方面的影響，結果發現，不同的藥物對其影響是不同的，且都呈現一定的毒性反應。

通過比較麻黃湯、小柴胡湯、葛根芩連湯這三個經典方劑的超微飲片與傳統飲片水煎液對斑馬魚胚胎毒性的影響時，發現超微中藥飲片毒性大于傳統中藥飲片，為超微飲片臨床用藥安全性提供實驗依據[12]。

Pyun等[13]通過綠茶中微量成分表兒茶精對斑馬魚因抑制活性氧防止輻射誘發聽細胞死亡作用的研究。結果表明：表兒茶精對輻射誘發的胚胎毒性有明顯減弱作用，并能防止輻射誘發的神經丘毛細胞減少，將其作為防治輻射誘發耳毒性的安全有效候選藥物。

通過以上在中藥毒性的胚胎、心臟毒性的研究中對斑馬魚模型的應用和前人通過斑馬魚模型對藥物毒性篩選的研究，充分顯示了斑馬魚模型在其他毒性方面的運用也有很大的空間，如心血管毒性、行為毒性等方面，但是運用斑馬魚對中藥毒性研究報道還很少。另外，由于斑馬魚與人和其他的哺乳動物存在一定的差異，且中藥是一個復雜的、多靶點的體系，與化學藥物單一成分的研究有很大的不同，所以運用斑馬魚模型在其他方面的毒性中藥的篩選的可靠性和適用性都還需要進一步的研究評價。

3 斑馬魚在中藥活性篩選和評價中的應用

隨著高通量篩選技術的發展，雖然可以通過體外篩選來獲得包括中藥成分在內的大量活性化合物，但由于很多中藥成分的復雜性，往往存在吸收、分布、代謝、排泄及毒性等方面的問題。所以，對這些活性化合物進行動物實驗鑒定非常必要。目前，用于藥物篩選的動物模型有很多，但存在各種不足因素，而由于斑馬魚的基因、遺傳等方面有高度的相似性，在藥物篩選方面具有巨大的潛能。利用基因突變的方法，建立各種斑馬魚疾病模型[14]，產生與斑馬魚突變系具有與人類疾病相似的癥狀，這對新藥篩選和內臟特異性毒理學研究起著至關重要的作用。

3.1 斑馬魚模型在中藥調節血管新生研究中的應用 在許多疾病的發生發展過程中，伴隨著機體對血管新生的調控失衡，特別是在腫瘤、風濕性關節炎等疾病的影響尤為突出。由于斑馬魚的胚胎發育透明，早期血管生成模式較簡單等特點和中藥本身的特點，斑馬魚整體器官模型在血管新生藥物的篩選方面起到重要的作用，更加適合于中藥活性成分的篩選[15]。

ZhaoH等人[16]利用斑馬魚的血管損傷模型發現當歸提取物水溶性成分SBD-4，能有效的復原斑馬魚的血管。此次發現也說明了通過轉基因斑馬魚篩選而發現的具有促血管新生活性的當歸提取物可作為治療血管新生不足類疾病潛在的藥物而改善人類的生活。

通過對地黃水提取物的不同溶劑萃取部位進行了活性篩選，采用轉基因斑馬魚 [TG (fli1：EGFP)y1/+(AB)]胚胎血管生成模型，并對活性部位主要化學成分進行了血管藥效學研究。發現地黃水粗提取物可增加斑馬魚腸下靜脈毛細血管形成數量，且有促進血管生成的作用[17]。

3.2 斑馬魚模型在中藥對神經系統方面的應用 具有神經活性的小分子是治療精神類疾病的主要藥物來源，但這類藥物存在較難發現與鑒定等方面的難題。而利用斑馬魚可有效篩選影響生物體復雜功能行為并治療神經系統疾病的藥物。目前，在運用斑馬魚于中藥對神經系統方面的研究主要集中在對學習記憶、血腦屏障和一些相關性疾病方面的研究。

3.2 .1 斑馬魚在學習與記憶研究中的應用 在學習與記憶研究中，斑馬魚具有兩個突出的優點，一是利用斑馬魚幼魚的透光性，運用注射熒光染料或者轉基因的方法，我們可以通過成像實時觀察神經系統的活動。其二是可以記錄清醒斑馬魚上的在體電生理神經元的電活動。

通過對東莨菪堿致記憶障礙斑馬魚模型的防治作用的中藥研究，發現槲皮素和蘆丁藥物都可預防由東莨菪堿導致的記憶障礙，而且不影響魚體的正常運動，并提出槲皮素和蘆丁等藥物成分可以作為神經系統疾病 (如阿爾茨海默癥)的治療藥物[18]。

通過對一些中藥進行斑馬魚免疫染色和行為學試驗篩選，Zhang ZJ等人[19-20]篩選到益智仁提取物 (AOE)和谷精草提取物 (EB)的神經保護作用。AOE乙醇提取物可以預防和恢復6-OHDA誘導的多巴胺神經元退化，對斑馬魚的游泳行為缺陷具有改善作用。EB可以恢復多巴胺神經元的損傷，延長6-OHDA模型斑馬魚的運動距離，發揮神經保護作用，并劑量依賴性作用。

3.2 .2 斑馬魚在一些神經疾病方面的研究 利用斑馬魚藥物依賴模型對鉤藤提取物進行研究，結果表明鉤藤提取物對甲基苯丙胺等神經依賴性藥物具有治療干預作用[21]。根據斑馬魚的生理學特性和現在對抗焦慮模型的對比，方芳[22]等提出運用新魚缸潛水實驗和報警信息素兩種途徑建造模型來篩選中藥的抗焦慮療效，并提出了其優越性，為篩選抗焦慮中藥提供了依據。此外，斑馬魚模型在中藥治療憂郁癥、睡眠紊亂等神經系統疾病的篩選也有相關的研究。

3.3 斑馬魚在抗骨質硫松中藥活性成分篩選的應用由于斑馬魚和人類在骨骼發育過程中的基因、信號通路有高度同源性，而且其幼魚透明的身體使得能在活體的狀況下對斑馬魚體內的骨架形成及發育進行觀察，并可以使用染料對骨架進行染色，能進一步對骨骼的大小和骨密度進行定量化。而由于斑馬魚的生理特性和中藥的多成分、多靶點的特點，采用斑馬魚建立壯骨效應評價新模型，有望成為體現中藥整體觀的，兼具體優勢、靈敏、高效地評價中藥抗骨質疏松效應的目標。

王娟[23]等研究淫羊藿苷對牙齒鈣磷沉積的影響，結果表明淫羊藿苷對牙齒發育中的鈣磷沉積有一定的影響，這對于在臨床上齲病的防治有良好的指導意義。為進一步明確將斑馬魚作為牙齒發生發育分子生物學研究模型的可行性和先進性；研究牙齒發育的重要信號因子 （Pax9基因、Pitx2基因）在牙發生發育過程中的作用機制及作用途徑和淫羊藿苷對牙齒生長發育的影響，李瑾等[24]對斑馬魚的組織結構和超微結構及斑馬魚背腹軸形成和骨化相關基因的研究。

3.4 斑馬魚在中醫針灸經絡研究中的應用 在中醫研究中，經絡和穴位的研究一直是個難點，也是眾多中醫藥研究者研究的熱點，穴位主要功能是感覺，針刺穴位所產生的酸麻脹痛熱等針效均表現為感覺器官的反應。有研究發現，感覺器官在軀體的有規律的集中分布在功能上類似于穴位。中醫對經絡的經典描述與研究所觀察到的感覺器官所形成的線類似，都形成若干條線。因此，有研究者推測斑馬魚存在類穴位與類經絡結構；斑馬魚皮膚感覺器官并不是均勻地分布于全身，而是若干感覺器官聚集在一起形成有規律的簇，而若干簇又有規律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統經絡與穴位[25]。這一研究對中醫的經絡學說的繼續發展具有有力的推動作用，并對中藥與針灸學相結合的穴位給藥提供了強有力的實驗模型。

4 斑馬魚模型在中藥藥物代謝研究中的應用

近年來，對中藥藥物代謝的研究主要借助于化學藥物代謝的基本理論和方法，通過對藥物在體內吸收、分布、代謝等過程的變化，并用動力學原理闡明動態變化的規律。斑馬魚作為研究體內藥物代謝的平臺已逐漸引起中醫藥學者關注。

Li ZH等[26]首次利用蛋白質組學以及轉錄組學的方法檢測到斑馬魚與哺乳動物的代謝酶體系極度相似性，從而構建了斑馬魚研究中藥及其單體藥物代謝的平臺。他們還用多種方法：包括蛋白組學等研究手段，對淫羊藿黃酮類化合物如淫羊藿素、淫羊藿苷和朝藿定C在斑馬魚體內分布和代謝機制進行研究。結果闡述了淫羊藿黃素及其衍生物在斑馬魚整體模型中的代謝途徑、分布機制，為斑馬魚成為一種實用的體內代謝篩選模型提供了理論依據[27]。Hu G等人[28]通過LC-MS/MS方法，鑒定分析毛蕊異黃酮在斑馬魚幼魚中吸收和代謝的產物，表明毛蕊異黃酮可能的代謝途徑有葡萄糖醛酸化、糖基化、硫酸化、氧化或上述兩種代謝過程。

5 展望

斑馬魚由于其發育快、胚胎期透明以及可用于大批量的快速篩選等諸多優點，已經被廣泛用于胚胎分子發育與疾病模型的構建，以及藥物篩選等研究的模式生物，且逐漸成為開展中醫藥研究的一個重要的體內模型。目前斑馬魚應用于中醫藥的研究還處于探索階段，并主要集中在中藥成分組分的研究應用、藥效成分的篩選上。但根據已取得研究結果可以肯定，斑馬魚在解決中藥復方研究中的幾個關鍵問題——是否有效、為什么有效、什么成分有效上均可發揮重要作用。因此，結合傳統中醫藥理論、臨床實踐及現代研究進展，應用斑馬魚生物模式開展藥效學、藥物代謝學及毒理學等全方面多角度的中藥研究前景較為理想。隨著斑馬魚轉基因模型的發展以及更多的斑馬魚疾病模型的建立，將會為今后中醫藥國際化提供更多全面而又便利的科研平臺和更為科學的理論依據，也將為中醫藥現代化的進程提供新興的動力。

[1]Sun ZH， Jia SJ， Meng AM.Zebrafish：swimming in life sciences [J].Chin Bull Life Sci(生命科學)， 2006， 18：431-436.

[2]Crawford AD，Esguerra CV，de Witte PA.Fishing for drugs from nature：Zebrafish as a technology platform for natural product discovery.Planta Med，2008， 74(6)：624-632.

[3]Wang JJ， Xu C， Tu Y， et al.Experimental research and application of zebrafish and embryos in toxicology [J].Asian JEcotoxicol(生態毒理學報)，2007， 2：123-135.

[4]紀喜文，田雪，徐殿勝．一種新型轉基因斑馬魚毒物檢測系統的建立[J]．化學與生物工程，2010，27(9)：69-72.

[5]Zhang XM，Chen LH，Zheng RK，et al.Histopathological changes of heart and brain in zebrafish exposure to Eupatorium odoratum extract[J].JGuangdong Ocean Univ(廣東海洋大學學報)， 2010， 30：27-32.

[6]王思鋒，劉可春，王希敏，等．雷公藤紅素對斑馬魚胚胎心臟毒性的初步研究．中國藥理學通報，2009，25(5)：634-636.

[7]黃惠琳，劉華鋼，蒙怡，等．氯化兩面針堿對斑馬魚胚胎心臟影響的初步研究．廣西醫學，2011，33(5)：546-548.

[8]黃惠琳，劉華鋼等．氯化兩面針堿對斑馬魚胚胎SOD和MDA的影響[J].毒理學雜志，2011，25(4)：243-245.

[9]田麗莉，董建勇，黃長江．莪術醇對斑馬魚胚胎發育的影響．溫州醫學院學報，2010，40(6)：557-559，563.

[10]姜瑋，王新敏，唐于平，等．甘遂不同提取物對斑馬魚急性毒性的初步觀察[J]．南京中醫藥大學學報，2012，28(1)：53-56.

[11]Wang JN，Huang J，Huang RB，et al.Effects of Col chicine on the activities of SOD and Na+-K+-ATPase in the Liver and Branchi of Brachyclanio rerio(Zebrafish)[J].Guangxi Sciences， 2010， 17(2)：144-147.

[12]王薇，劉宇聰，佟麗．麻黃湯等超微飲片與傳統飲片對斑馬魚胚胎毒性的比較研究[J]．中藥新藥與臨床藥理．2011，22(5)：488-491.

[13]Pyun JH，Kang SU，Hwang HS，et al.Epicatechin inhibits radiation-induced auditory cell death by suppression of reactive oxygen species generation[J].Neuroscience.2011，199：410-420.

[14]Lieschke GJ， Currie PD.Animalmodels of human disease：zebrafish swim into view[J].Nat Rev Genet，2007， 8：353-367.[15]Raghunath M，Sy Wong Y，Farooq M，etal.Pharmacologically induced angiogenesis in transgenic zebrafish[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，378：766-771.

[16]Zhao H，Deneau J，Che GO，Li S，Vagnini F，Azadi P，Sonon R，Ramjit R，Lee SM，Bojanowski K．，Angelica sinensis isolate SBD．4：composition，gene expression profiling，mechanism of action and effect on wounds，in rats and humans．Eur JDermat01．2012 Jan-Feb；22(1)：58-67.

[17]Liu CL， Cheng L， Kwok HF， et al.Bioassay-guided isolation of norviburtinal from the root of Rehmannia glutinosa，exhibited angiogenesis effect in zebrafish embryo model[J].J Ethnopharmacol， 2011， 137：1323-1327.

[18]Richetti SK，Blank M，Capiotti KM，et al.Quercetin and rutin prevent scopolamine-induced memory impairment in zebrafish [J].Behav Brain Res，2012， 17：10-15.

[19]Zhang ZJ，Cheang LC，Wang MM，Li GH，Chu IK，Lin ZX，Lee SMY.Ethanolic extract of Fructus Alpinia oxyphylla protects against 6-hydroxydopamine-induced damage of PC 12 cells in Vitro and dopaminergic neurons in zebrafish．Cellular and Molecular Neurobiology，2012 Jan；32(1)：27-40．

[20]Wang M，Zhang Z，Cheang LC，eta1.Eriocaulon buergerianum extract protects PC 12 cells and neurons in zebraflsh against 6-hydroxydopamine-induced damage.Chin Med．2011，6：1 6.

[21]陳毅飛，莫志賢.模式生物斑馬魚藥物依賴模型的建立以及中藥的干預機制[D].廣州：南方醫科大學，2012.

[22]方芳，余林中.斑馬魚—一種可用于中藥抗焦慮藥研究的模式生物[J].中藥藥理與臨床，2011；27(1).104-106.

[23]王娟，徐艷，陳武，等.斑馬魚牙齒的組織結構和超微結構特征[J].口腔醫學研究，2009，25(6)703-705.

[24]李謹.牙齒發育的信號調控機制及淫羊藿苷的干預研究[D].南京中醫藥大學博士學位論文，2010.

[25]晉志高，景向紅，李繼偉，等.斑馬魚體表類穴位與類經絡結構的初步觀察[J].中國針灸，2007（02）：117-119.

[26]Li ZH，Alex D，Siu SO，et a1.Combined in vivo imaging and omics approaches revealmetabolism of icaritin and its glycosides in zebrafish larVae.Mol Biosyst.2011;7：2128-38．

[27]Kong RP，Siu SO，Lee SM，Lo C，Chu IK.Development of online highlow-pH reversed—phase-reversed phase two-dimensional liquid chromatography for shotgun proteomics：A reversed phase—strong cation exchange reversed-phase approach.Journal of Chromatography A.2011 Jun 10;1218(23)：3681-8．

[28]Hu G，Siu SO，Li S，Chu IK，Kwan YW：Chan SM Leung George PH，Yan R，Lee，Simon MY.Metabolism of calycosin， an isonavone from Astragali Radix， in zebrafish larvae.xenobiotica．2012Mar;42(3)：294-303.