從膽汁流量和膽汁酸成分改變初探“膽道不利是肥胖發病的中心環節”

李德剛 高 敏 沙妙青 李曉蕓 楊柏燦

（上海中醫藥大學中藥學院，上海，201203）

從膽汁流量和膽汁酸成分改變初探“膽道不利是肥胖發病的中心環節”

李德剛 高 敏 沙妙青 李曉蕓 楊柏燦

（上海中醫藥大學中藥學院，上海，201203）

目的：通過對比高脂、正常大鼠膽汁流量、膽汁酸組分含量變化，初步揭示“膽道不利是肥胖發病中心環節”假說的內在依據。方法：高脂喂養造成大鼠營養性肥胖模型；實施膽管插管手術，引流膽汁，觀測、對比膽汁流量差異；利用UPLC-MS技術觀測、對比各膽汁酸亞組分含量差異。結果：高脂組大鼠總膽汁流量及各測試點膽汁流量均低于正常組；高脂大鼠機體內具有利膽、促進脂肪代謝作用的膽汁酸含量顯著降低。結論：過量攝入高脂飲食，會加重膽代謝脂質的負擔，造成膽道不利、膽汁不暢、膽汁酸組分改變，脂質代謝長期失衡，久則積聚，發為肥胖。

營養性肥胖；膽道不利；脂質代謝；膽汁流量；膽汁酸組分

近年來有文獻報道肥胖、高脂血癥等代謝性疾病與膽道疾病具有相關性［1-6］，筆者導師在臨床上亦發現高脂肥胖患者常兼具如下特征：長期飲食不節不律；多伴有高血脂、脂肪肝、糖尿病等；常兼患膽囊炎、膽結石等膽道疾病。對此，通過對膽在人體中所占地位的中醫理論的深入研究，導師提出：膽作為人體“中正之官”，具有“藏瀉并兼”的特性，可協調五臟六腑藏、瀉、滿、實的動態平衡；膽汁是膽發揮功能的物質基礎，膽通過對膽汁的貯藏排泄，實現對食物的消化、吸收、排泄的調節，從而達到人體物質能量代謝動態平衡［7］。對膽汁的現代研究表明：膽汁中主要成分是膽汁酸，膽汁酸在脂類代謝中發揮著舉足輕重的作用。其能增加脂肪在小腸的吸收、增強脂肪酶的活性、促進脂類乳化、在調節能量代謝中充當信號分子等。因此，若膽道不利、膽汁不暢、膽汁酸成分改變，勢必引發脂質代謝障礙，進一步則發為肥胖。那么這一現象能否在實驗中得以再現呢？為此，我們通過高脂喂服成年雄性SD大鼠制作營養性肥胖模型，引流膽汁，觀察正常、高脂大鼠膽汁流量及膽汁酸亞組分的差異，以判斷高脂肥胖大鼠的膽道狀況，為膽道不利、膽汁不暢是肥胖發病中心環節的假說提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠68只，體重（160±20）g左右，購自必凱實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2008-0016，飼養于上海中醫藥大學SPF級動物房中，適應性喂養7 d，適應期結束時，大鼠體重達（200±20）g左右。

1.2 高脂飼料 飼料營養配比為：20%粗蛋白+40%脂肪+40%碳水化合物，由上海斯萊克試驗動物有限責任公司提供。

1.3 實驗試劑 乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20101128；甲醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20110129；甲酸，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20110523；醋酸銨，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20090109。

2 實驗方法

2.1 大鼠營養性肥胖模型制備 所有大鼠適應性喂養結束后，依次稱重編號，隨機抽出8只作為正常組，喂以普通飼料；其余60只為高脂組，喂以高脂飼料。兩組大鼠體重在實驗前無統計學意義（見表1）。造模中途進行“肥胖抵抗大鼠剔除”后（方法及結果詳見《實驗性營養性肥胖模型制作的關鍵因素探析》一文），以高脂組平均體重超出正常組平均體重20%［8］為造模截點（以下簡稱“20%標準”）。造模期間兩組大鼠自由進食、飲水，每周稱重1次。

2.2 樣本收集

2.2.1 血清收集 采取腹主動脈取血，血液靜置2 h，低溫離心（4℃，5 000 r/min，離心15 min），分離血清并分裝。

2.2.2 膽汁收集和流量測定 實施膽管插管手術，引流大鼠膽汁。調整大鼠至膽汁流出順暢的最佳體位，以2 mL離心管收集膽汁。從膽汁剛流出起計時10 min，之后更換全新離心管，此時開始正式收集膽汁。膽汁每30min收集1管，連續收集240min。以移液管測定每管膽汁量，記為本30 min內膽汁流量，單位：mL/30 min。

2.3 血清中膽汁酸亞組分含量測定

2.3.1 血清前處理 將血清與甲醇按1∶3比例混勻，渦旋振蕩1 min，離心（4℃，12 000 g，離心10 min），取上清液，氮氣吹干（35℃），殘渣用100μL的初始流動相（0.1%甲酸+5 mmol CH3COONH4∶甲醇（45∶55）復溶，渦旋振蕩1 min，離心（4℃，12 000 g，離心10 min），吸取上清液進樣。

2.3.2 血清UPLC-MS測定條件［9］色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.0 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫45℃，流動相A相為甲醇，B相為0.1%甲酸+5 mmol CH3COONH4。采用梯度洗脫，順序見表1。每次進樣2μL，流速0.3 mL/min。

質譜條件：選用負離子模式下電噴霧電離，離子檢測模式定量的方法，離子源溫度為120℃，去溶劑化溫度為300℃，去溶劑化氣流流速700 L/h，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓55 V，錐孔氣流流速50 L/h。

表1 液相洗脫順序

2.4 膽汁中膽汁酸亞組分含量測定

2.4.1 膽汁前處理 將膽汁與甲醇按1∶200比例混勻，超聲3min，離心（15℃，1 600 g，離心10 min），收集上清，殘渣加入乙醇，渦旋1 min，離心。收集上清液，合并兩次上清液并揮干，加入1 mL甲醇，渦旋1 min，吸取10μL進樣。

2.4.2 膽汁UPLC-MS測定條件 同“2.3.2”。

2.5 測定指標

2.5.1 營養性肥胖模型 大鼠行為學觀察：觀察兩組大鼠日常大鼠精神狀態、毛發、糞便等狀況。體重：以周為單位記錄大鼠體重，單位：g。

2.5.2 膽汁流量 膽汁分流量：用移液器測定大鼠每30 min膽汁流量，單位：mL/30min。膽汁總流量：測定大鼠240 min內膽汁總流量。單位：mL。

2.5.3 膽汁酸亞組分含量 應用UPLC-MS測定血清和膽汁中各膽汁酸亞組分含量，單位：ng/m L。

2.6 統計方法 不同的資料采用不同的統計方法。當資料滿足正態分布且方差齊性時，采用兩樣本t檢驗；當資料不滿足正態分布或/和方差不齊時，采用Mann-Whitney U檢驗；膽汁酸含量數據用MassLynx 4.1軟件采集和輸出。所有數據均采用SPSS 16.0統計軟件進行統計。結果采用均數±標準差（±s）表示。

3 實驗結果

3.1 營養性肥胖造模

3.1.1 兩次初始體重驗證 兩次初始體重驗證結果分別為：P＝0.890＞0.05；P＝0.086＞0.05。兩次驗證均有力佐證正常組、高脂組大鼠初始體重的差異無統計學意義，兩組大鼠后期體重差異均由高脂喂養所致。詳見表2。

表2 兩次初始體重驗證（g）

3.1.2 日常行為學觀察 造模期間，高脂組大鼠毛發偏油亮，部分甚至出現毛發變黃；籠內糞便多，氣味濃重，須頻繁更換墊料；多團縮于角落，行動遲緩，精神萎靡；抓取之并無劇烈反抗，但甩尾力量大。正常組大鼠精神狀態良好，行動靈活，毛發、糞便均未出現異樣，抓取時常伴有強烈掙扎。

3.1.3 體重比較 肥胖抵抗鼠剔除后，以“20%標準”為造模截點，結果顯示：造模共歷時9周，高脂組大鼠平均體重超出正常組大鼠平均體重21.09%，在高脂喂養第2周時，兩組大鼠平均體重即已出現顯著性差異。表明：高脂組大鼠體重已達到營養性肥胖標準。詳見表3、圖1、圖2。

表3 正常組、高脂組大鼠體重變化（±s）

表3 正常組、高脂組大鼠體重變化（±s）

注：正常組與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

周數（week）正常組（g）高脂組（g）0 206.13±4.70 208.10±7.25 1 255.75±11.03 272.67±12.84*2 297.75±15.85 331.57±18.41 3 327.75±17.84 375.67±19.47 4 355.25±33.55 415.27±22.34 5 400.00±20.29 448.30±25.45 6 421.88±21.50 478.87±26.81 7 438.13±21.55 510.37±31.35 8 451.50±20.63 528.17±34.89 454.13±37.46 549.90±31.57 9

圖1 正常組、高脂組大鼠體重變化曲線圖

圖2 正常組、高脂組大鼠體型對比

3.2 膽汁流量比較 觀察兩組大鼠膽汁流量，發現以下特征：1）在膽汁流量趨勢變化上，兩組大鼠膽汁流量均隨時間延長呈現遞減趨勢；2）在各時間點膽汁流量上，正常組在每個測試點的平均膽汁流量均高于高脂組；3）在總膽汁流量上，在收集的240 min內，正常組總膽汁流量高于高脂組。以上結果提示：相較正常個體，肥胖個體會呈現膽汁分泌減少、膽汁分泌不暢的特征。詳見表4、圖3。

表4 正常組、高脂組大鼠膽汁流量比較

圖3 正常組、高脂組大鼠膽汁流量比較

表5 正常組、高脂組大鼠血清中各膽汁酸亞組分含量比較

3.3 膽汁酸亞組分含量比較

3.3.1 血清中膽汁酸亞組分含量比較 血清中各膽汁酸亞組分檢測結果顯示：在檢測到的10種膽汁酸組分中（牛磺熊去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、豬去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸），除牛磺熊去氧膽酸、豬去氧膽酸外，高脂組較正常組各膽汁酸亞組分含量均呈現不同程度下降。其中牛磺豬去氧膽酸、牛磺膽酸、熊去氧膽酸3種膽汁酸含量在兩組間存在的差異具有統計學意義（P＜0.05）；高脂組甘氨膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、去氧膽酸含量較正常組僅有一定程度下降，不具有統計學意義。提示：肥胖發病時，機體血清中某些膽汁酸含量會呈現下降甚至顯著下降特征。詳見表5、圖4。

圖4 正常組、高脂組大鼠各膽汁酸組分比較

表6 正常組、高脂組大鼠膽汁中各膽汁酸組分含量比較

3.3.2 膽汁中膽汁酸亞組分含量比較 膽汁中各膽汁酸亞組分檢測結果顯示：在檢測到的6種膽汁酸組分中（牛磺熊去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸），高脂組較正常組各膽汁酸含量均呈現不同程度下降。其中牛磺熊去氧膽酸、甘氨膽酸含量在兩組間有統計學意義（P＜0.01），牛磺豬去氧膽酸、熊去氧膽酸、牛磺膽酸含量在兩組間有統計學意義（P＜0.05）；高脂組牛磺鵝去氧膽酸含量較正常組僅有一定程度下降，不具有統計學意義。提示：肥胖發病時，機體膽汁中某些膽汁酸含量會呈現下降甚至顯著下降特征。詳見表6、圖5。

4 討論

中醫稱膽為中精之府，結構似腑，功能似臟，藏瀉并兼，其貯藏膽汁有“精汁”之美譽。膽汁乃肝之余氣溢入于膽所化生，膽疏泄膽汁于腸胃參與水谷運化，以通為順，現代研究亦表明：膽汁酸是存在于膽汁中一類膽烷酸的總稱，是膽汁中除水以外的最主要成分。膽汁酸與脂質代謝具有十分密切的關系。膽汁酸途徑是膽固醇體內代謝的主要途徑，人體每日近半數的膽固醇被分解成為膽汁酸后經肝臟排出體外。膽汁酸在機體內主要以膽汁酸鹽的形式存在，脂肪的消化主要發生在小腸，必須經過膽汁酸鹽及各種酶的作用，方能水解為脂肪酸和甘油。綜上不難看出：膽汁疏泄通暢，則肝氣調達，全身氣機條暢。可保一身之物質能量代謝平衡。但凡能影響膽疏泄通降的因素都能引起膽道功能不調，膽汁不暢，從而直接妨礙正常脂質代謝。

本研究證實：肥胖大鼠在膽汁總流量、膽汁分流量以及部分膽汁酸亞組分含量上均呈現不同程度下降，在含量下降顯著的膽汁酸亞組分中，牛磺熊去氧膽酸是在肝臟內形成的結合型次級膽汁酸，具有抗炎、利膽、溶石作用［10］；甘氨膽酸是在肝臟內形成的結合型初級膽汁酸，有助于脂肪消化吸收［11］；熊去氧膽酸是在腸道內生成的次級膽汁酸，其膽酸鹽具有顯著的利膽作用，能增強膽汁酸的分泌，降低膽汁中膽固醇及膽固醇酯的含量［12］；牛磺膽酸是在肝臟內生成的結合型初級膽汁酸，能刺激肝細胞分泌膽汁，并促進脂肪的乳化和吸收，有利于脂溶性維生素吸收［13］；膽酸是在肝臟內生成的初級膽汁酸，在膽汁中以甘膽膽酸或牛磺膽酸的形式存在，可促進脂類的消化和吸收［14］；牛磺豬去氧膽酸具有抗炎和促進組織修復作用，并能調節免疫，對實驗性潰瘍性結腸炎具有一定的治療作用［15］。從中不難發現：肥胖發病時，機體內具有促進膽汁分泌、促進脂肪消化吸收作用的膽汁酸含量會顯著降低。

綜上所述初步推測：過食高脂厚味會加重膽調節脂質代謝的負擔，致使膽道功能紊亂，突出表現為膽汁分泌量減少，膽汁分泌不暢，并進一步可造成機體內中具有利膽、促進脂肪代謝作用的膽汁酸組分含量減少，長此以往，體內脂類長期代謝失衡，日久積聚，發為肥胖。此乃膽道不利為肥胖發病之中心環節的內在依據。本研究從實驗角度初步揭示了膽道不利與肥胖發病的關聯，隨著后續對膽汁酸特性及作用機制的進一步探索，必將為肥胖的防治提供新的思路和方法。

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（2013-05-26收稿 責任編輯：徐暉）

Preliminary Exploration on＂Biliary Tract Adverseness is the Central Link of Obesity＂by Changing Bile Flow and Bile Acid Components

Li Degang，Gao Min，Sha Miaoqing，Li Xiaoyun，Yang Baican
（Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

Objective：By comparing the difference of bile flow and bile acid components between high-fat and normal rats，we tried to reveal the basis of hypothesis which biliary tract adverseness is the central link of obesity.Methods：Building nutritional obesity rat model by high fat diet.Bile duct intubation operation was implemented to collect bile and then compare the bile flow difference.UPLC-MS was used to compare the content of different kinds of bile acid components.Results：Both total and individual test point bile flow of obese rats were lower than those of normal rats.The content of bile acids that had cholagogic effect and promoting fat metabolism in highfat diet rats reduced significantly.Conclusion：Intaking excessive high-fat diet can increase the burden of bile，resulting in biliary tract adverseness，an unsmooth flow and changes of bile acid components.Long-term imbalance of lipid metabolism will finally leads to obesity.

Nutritional obesity；Biliary tract adverseness；Lipid metabolism；Bile flow；Bile acid components

Q548+.5；R723.14

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.030

楊柏燦，教授，碩士研究生導師，從事中藥復方藥效評價、中藥學教學和中醫臨床研究工作，Tel：021-51322208，E-mail：bcy2002＠sina.com