pB2R-Venus重組真核載體的構(gòu)建及在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)*

季丙元 程葆華 王春梅 陳 京△ 白 波△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所,山東 濟(jì)寧 272067；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 泰安 272018)

激肽是重要的促炎癥多肽，由激肽釋放酶作用于激肽原產(chǎn)生，酶解產(chǎn)物緩激肽和胰激肽主要通過(guò)緩激肽2型受體(bradykinin receptor 2,B2R)起作用。B2R是一種G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)，能調(diào)節(jié)心血管平衡、增加血管通透性[1]和NO的釋放[2]，同時(shí)還能促進(jìn)炎癥反應(yīng)和傷害性效應(yīng)，B2R目前已成為重要的藥物靶標(biāo)。近年來(lái)，有關(guān)GPCR二聚化或寡聚化的研究日益增多[3-4]，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pB2R-Venus真核表達(dá)載體可通過(guò)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)或雙分子熒光互補(bǔ)等研究技術(shù)發(fā)揮作用，用來(lái)研究BDKRB2同其他受體或蛋白間的相互作用，也可用于研究受體的脫敏、內(nèi)化、泛素化等過(guò)程，闡明受體作用的機(jī)制，從而有助于進(jìn)一步探討其作為藥物靶標(biāo)的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

含人B2R全長(zhǎng)cDNA基因序列的重組載體pcDNA3.1-B2R和含Venus編碼序列的重組載體(Clontech公司)。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶均購(gòu)自Fermentas公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒及無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提及小提試劑盒均購(gòu)自北京天根生物有限公司；HEK293T細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1目的基因的獲取及引物設(shè)計(jì) 登錄Genebank獲取人BDKRB2(B2R) cDNA序列(AY275465)，根據(jù)B2R序列特點(diǎn)和pVenus-N1的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并在引物末端引入酶切位點(diǎn)。由引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)出引物，正向引物序列為：5’-CCCGAATTCACCATGTTCTCTCCCTGGAAGATATCA-3’(含EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，反向引物序列為：5’-CGCGGATCCGCCTGTCTGCTCCCTGCCCAGTC-3’(含BamHⅠ酶切位點(diǎn))。……