EPO促進胚胎神經干細胞向神經元分化的形態學研究*

袁麗麗 馬登殿 孔佑華

(1濟寧醫學院基礎學院，山東 濟寧 272067；2濟寧醫學院附屬醫院，濟寧 272029)

近些年，促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)對中樞神經系統的保護作用[1]研究較多。本實驗鏡下取大鼠14d天胚胎腦皮質行體外培養，鑒定為神經干細胞(nerual stem cells,NSCs)之后培養基中加入不同濃度的EPO繼續體外培養，觀察NSCs向神經元方向分化的形態學表現。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

成年雌雄未經產SD大鼠晚8：00合籠，次日晨8：00查到精子者記為E0d。

懸浮培養基：DMEM/F12(1∶1，Hyclone)，20 ng/mlEGF(Sigma)，20 ng/mlbFGF(Sigma)，2%B27(Gibco)，100 u/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素。貼壁分化培養基：DMEM/F12(1∶1，Hyclone)，10%FBS(杭州四季青)，100u/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素。

1.2 方法

1.2.1NSCs培養和鑒定

1.2.1.1NSCs的分離和傳代及自然分化 取孕14d(E14d)SD大鼠胚胎腦皮質，用袁麗麗等[2-3]培養方法先懸浮培養傳代3次，第3代(P3)細胞懸浮培養7d，收集部分細胞離心后待做電鏡標本，其余懸浮細胞移入涂有L-多聚賴氨酸包被蓋玻片的24孔培養板中加入分化培養基。放入培養箱培養6～8h，隨機選取培養板，將蓋玻片固定，待行nestin免疫細胞化學染色。其余培養板繼續行分化培養，7d后取出細胞爬片固定，待行神經膠質原纖維酸性蛋白(glia fibrillary acid protein，GFAP)、微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)免疫細胞化學染色。

1.2.1.2免疫細胞化學染色 Nestin、GFAP、MAP2進行免疫細胞化學染色[2]。

1.2.2EPO摻入實驗

1.2.2.1分組 第3代NSCs懸浮及其后貼壁分化培養基中添加EPO，根據EPO終濃度0.5、5、50、500u/ml分為4個實驗組，另設對照組(不加EPO)。培養方法同上。

1.2.2.2免疫熒光染色 NSCs爬片7d固定行MAP2免疫熒光染色[3]。后行激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。每組隨機取4張蓋玻片，每張400倍鏡下隨機選5個視野計數MAP2陽性細胞數及總細胞數，計算視野中MAP2陽性細胞百分率。……