20（S）-原人參二醇誘導U87細胞凋亡的機理研究*

南一楠 李 嬌 李澎濤 華 茜△

（1．北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100029；2．北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

腦惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的原發(fā)性腫瘤，約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%～53%［1］。原人參二醇（PPD）是存在于人參和三七中的達瑪烷型四環(huán)萜烯皂角苷［2-3］。 20（S）-原人參二醇（aPPD）是人參皂苷經(jīng)過胃腸道菌群去糖代謝活化后產(chǎn)生的活性成分，具有廣譜抗腫瘤作用。本研究觀察aPPD對人膠質(zhì)瘤細胞U87的抑制殺傷作用，探尋其作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 細胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細胞U87購置于ATCC，培養(yǎng)在含有 10%胎牛血清（FBS，Gibco，NY）的 DMEM（Sigma）中，并加入青霉素和鏈霉素（Gibco-BRL，NY）防治細菌感染。于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為37℃。細胞達到80%密度時傳代，約3～4 d傳1代，40代之前的細胞用于實驗。

1．2 藥物與試劑 原人參二醇受贈于Pegasus制藥公司（Vancouver，BC），存儲液用純乙醇配制，濃度為80mmol/L，于4℃避光保存。使用時溶解于完全培養(yǎng)基內(nèi)，配制成所需終濃度。一抗anti-pro-caspase3（ab cam，ab47131，US）和 anti-PARP （Proteintech，13371-1-AP，US）均按 1∶1000稀釋， 溶解于 3%BSA的TBST中，4℃孵育過夜。

1．3 細胞活力檢測（MTS法） U87細胞接種于96孔板上，接種密度為每孔 2．5×104個，100 μL 每孔。 接種24 h后吸去培養(yǎng)基，重新添加新的含藥培養(yǎng)基。作用指定時間后，向每孔中加入20μLCellTiter 96 AQueous One Solution Reagent（Promega），于 5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，之后于490 nm處測量吸光度值，數(shù)值越大說明細胞活力越強。

1．4 蛋白提取與免疫印跡 藥物作用到指定藥物作用時間后，吸去培養(yǎng)基，用預冷的PBS輕輕清洗細胞表面1次，之后加入上樣緩沖液 ［62．5mmol/L Tris-HCl，2%SDS，10%甘油，50mmol/LDTT，0．01%（w/v）溴酚藍］，用細胞刮輕輕將裂解產(chǎn)物刮下，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)99℃加熱5min，之后離心，待蛋白冷卻后即可上樣。等量的蛋白上樣于SDS-PAGE膠上，待蛋白根據(jù)分子量大小分離開后進行轉(zhuǎn)膜 （BIO-RAD），采用NC膜，100 V轉(zhuǎn)1.5 h后將膜取出，于5%脫脂牛奶中封閉1 h后加入一抗4℃孵育過夜。次日吸走一抗，將膜用TBST洗3遍，每遍15min。之后選擇相應二抗進行孵育，室溫在搖床上孵育1 h，同樣用TBST清洗3遍，15 min每次。采用 ECL顯影液 （Perkin-Elmer Life Sciences，Boston，MA）進行檢測，拍攝圖像后用 Image J進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用 One-way ANOVA 比較。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTS法檢測結(jié)果 見表1。用不同濃度的aPPD處理U87細胞，24 h后用MTS法檢測細胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10μmol/L濃度的aPPD即對U87細胞有顯著的抑制作用，且隨aPPD濃度升高抑制作用愈明顯（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 不同濃度aPPD作用U87細胞24h后的MTS測定結(jié)果（±s）

表1 不同濃度aPPD作用U87細胞24h后的MTS測定結(jié)果（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

aPPD劑量 n 0μmol/L（對照組） 3 10μmol/L 3 20μmol/L 3吸光度值2.32±0.12 1.84±0.08**1.47±0.06**40 μmol/L 3 1.04±0.07**60 μmol/L 3 1.05±0.16**80 μmol/L 3 0.72±0.10**

2.2 免疫印跡檢測結(jié)果 不同濃度的aPPD作用于U87細胞后8 h，免疫印跡結(jié)果顯示pro-caspase3隨aPPD濃度升高呈逐漸減少趨勢 （圖1）。利用Image J進行定量分析其條帶光密度與β-actin的比值，結(jié)果可知40μmol/L以上濃度的aPPD會使pro-caspase3含量明顯下降（表2）。免疫印跡結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PARP有切割條帶的產(chǎn)生（圖2），說明當U87收到aPPD作用時，其細胞內(nèi)部的caspase3被激活。

圖1 不同濃度aPPD作用于U87細胞8h后pro-caspase3的變化

3 討 論

大量研究發(fā)現(xiàn)，PPD及其衍生物對多種腫瘤細胞具有殺傷性，并且對正常組織細胞無害［4-6］。aPPD對肝癌、肺癌以及黑色素瘤細胞具有明顯的生長抑制和殺傷作用［7］，并且能夠誘導骨髓瘤細胞的凋亡，治療白血病［8］。

表2 aPPD作用于U87細胞8 h后pro-caspase3的變化情況（±s）

表2 aPPD作用于U87細胞8 h后pro-caspase3的變化情況（±s）

aPPD劑量 n 0μmol/L（對照組） 3 10μmol/L 3 20μmol/L 3 pro-caspase3/actin 1.00±0.00 0.95±0.13 0.90±0.10 40 μmol/L 3 0.74±0.12*60 μmol/L 3 0.64±0.17**80 μmol/L 3 0.51±0.04**

圖2 不同濃度aPPD作用U87細胞后PARP的表達變化

關(guān)于其機制研究也廣泛展開，一項在體研究表明，20（S）-PPD對肝癌大鼠模型具有顯著療效，能夠抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成，降低微血管密度，并促進其凋亡［9］，其分子機制可能與抑制腫瘤組織血管內(nèi)皮生長因子的表達有關(guān)［10］；另一方面，它還能提高小鼠特異性和非特異性免疫功能［11］。有研究表明，Rh2的作用機制主要為 caspase 家族的激活［6，12］，Rh2 還與活性氧生成和 p21 活力有關(guān)［13-14］。

20（S）-PPD具有與Rh2相似的化學結(jié)構(gòu)，其殺傷腫瘤的作用機制尚未完全明確，因此筆者猜想其也有可能與caspase3的激活有關(guān)。caspase家族是一類存在于細胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，可以切割肽鏈上天冬氨酸之后的肽鍵，具有高度的特異性［15］。它們廣泛參與細胞凋亡的各個過程，因此越來越多地在腫瘤治療領(lǐng)域受到關(guān)注。包含凋亡起始者（caspase2、8、10）和凋亡執(zhí)行者（caspase3、6、7），caspase3 和 caspase7 具有相似的底物［16］，會降解 PARP、DFF-45 等，導致 DNA 修復抑制以及降解，進而導致細胞凋亡［17］。

細胞活力實驗結(jié)果顯示，aPPD對膠質(zhì)瘤細胞具有較好的殺傷作用，免疫印跡結(jié)果證明caspase3前體隨aPPD濃度增高而減少，具有明顯的相關(guān)性。而caspase3常見的底物PARP也被切割，說明U87細胞內(nèi)caspase3被aPPD誘導激活，從而進入凋亡狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)aPPD誘導U87細胞凋亡的途徑可能與caspase3的激活有關(guān)，然而天然提取物往往具有多靶點、多通道的作用機制，aPPD是否還具有其他殺傷腫瘤細胞的作用途徑，其如何激活caspase3等問題，尚待進一步深入研究。

［1］ 陳志剛，盧亦成，丁學華，等．惡性膠質(zhì)瘤化療新進展［J］．中華神經(jīng)外科雜志，2003，19（1）：70-72．

［2］ Shibata S，Tanaka O，Sado M，etal．The genuine sapogenin of ginseng［J］．Tetrahedron Letters，1963，4（12）：795-800．

［3］ Tanaka O，Nagai M，Shibata， S．Stereochemistry of protopanaxadiol，a genuine sapogenin ofginseng［J］．Tetrahedron Letters，1964，5（33-34）：2291-2297．

［4］ JiaWWG，Bu X，Philips D，etal．Rh2，a compound extracted from ginseng，hypersensitizes multidrug-resistant tumor cells to chemotherapy［J］．Canadian journalofphysiology and pharmacology，2004，82（7）：431-437．

［5］ Kim YS，Jin．Ginsenoside Rh2 induces apoptosis independently ofBcl-2， Bcl-xL or Bax in C6Bu-1 cells［J］．Archives ofpharmacal research， 1999，22（5）： 448-453．

［6］ FeiXF，Wang， etal．（2002）．Apoptotic effectsofginsenoside Rh2 on humanmalignantmelanoma A375-S2 cells［J］．Acta Pharmacologica Sinica，2002，23（4）：315-322．

［7］ 辛穎，倪勁松，王心蕊，等．20（S）-人參皂苷 Rg3抗 B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用［J］．吉林大學學報：醫(yī)學版，2004，30（4）：540-543．

［8］ Tanious FA，LaineW，Peixoto P，etal．Unusually strong binding to the DNA minor groove by a highly twisted benzimidazole diphenylether：induced fitand bound water［J］．Biochemistry，2007，46（23）：6944-6956．

［9］ 秦俊杰，楊艷秋，李穎新，等．20（S）2原人參二醇對肝癌間質(zhì)血管密度和腫瘤細胞增殖活性的影響［J］．臨床肝膽病雜志，2006，22（4）：260-261．

［10］張國成，秦俊杰，冷吉燕．20（S）2原人參二醇抑制肝癌血管內(nèi)皮生長因子及其基因的表達［J］．中國老年學雜志，2006，26（7）：945-946．

［11］王庭富，孟正木．人參皂苷Rg3對免疫功能的影響［J］．中國醫(yī)科大學學報，1999，30（2）：133-135．

［12］ Park J．Activation of caspase-3 protease via a Bcl-2-insensitive pathway during the process of ginsenoside Rh2-induced apoptosis［J］．Cancer Letters，1997，121（1）：73-81．

［13］ Kim HE．Ginsenoside RH-2 induces apoptotic cell death in rat C6 glioma via a reactive oxygen-and caspase-dependent but Bcl-X＜sub＞L＜/sub＞-independentpathway［J］．Life sciences，1999，65（3）：33-40．

［14］ Oh M．Anti-proliferating effects ofginsenoside Rh2 on MCF-7 human breast cancer cells［J］．International journal of oncology，1999，14（5）：869．

［15］ Fan， TJ， Han．Caspase family proteases and apoptosis［J］．Acta biochimica etbiophysica Sinica，2005， 37 （11）： 719-727．

［16］ Talanian RV，Quinlan．Substrate specificitiesof caspase family proteases［J］．Journal of Biological Chemistry，1997，272（15）：9677-9682．

［17］ Porter AG，Jnicke RU．Emerging roles of caspase-3 in apoptosis［J］．Celldeath and differentiation，1999，6（2）：99．