滅幽湯治療幽門螺桿菌相關性胃炎脾胃濕熱證的機理研究*

王小娟 杜中華 喻 斌 郭建生△ 羅 燕 夏 蓉 尹 姣

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410007）

幽門螺桿菌相關性胃炎（HAG）在臨床辨證分型中多表現為脾胃濕熱證［1-4］。筆者的臨床經驗方——滅幽湯在治療HAG脾胃濕熱證方面取得了良好療效，其功效為清熱利濕、理氣制酸止痛。本課題組對滅幽湯作了一系列的臨床和實驗研究［5-11］，在此基礎上進一步探索滅幽湯的作用機理。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級8周齡BALB/c小鼠54只，雌雄各半，購自南京君科生物科技有限公司。實驗動物質量合格證號 0017145，許可證號 SCXK（蘇）2011-0003。

1.2 Hp菌種 悉尼標準菌株 （Sydney strain 1，SSI），SSI含有細胞毒素相關基因（cagA）蛋白和空泡細胞毒素（vacA），濃度為 Hp菌液 1×109cfu/mL，由湖南中醫藥大學基礎醫學院病原免疫學教研室提供。

1.3 藥物 滅幽湯（黃芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陳皮、烏賊骨）組方藥材均購于湖南省藥材公司飲片加工廠，經湖南中醫藥研究院鑒定，符合《中國藥典》相關標準；藥物浸泡30min后，加水沒過藥面5 cm，武火煎至沸騰后改文火，繼續煎煮20min，取汁另置。繼續加水，煎煮沸騰后，文火續煎20min，取汁。兩次藥汁合并后濃縮至每毫升含生藥1 g，并用離心機去除藥汁中殘渣，4℃保存。枸櫞酸鉍鉀由麗珠醫藥生產，批號1212248。替硝唑由山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司出廠，國藥準字H20033090；克拉霉素由杭州中美華東制藥有限公司出廠，國藥準字H10970216。

1.4 儀器與試劑 HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海南陽；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡，德國LEICA；Shandon325型石蠟切片機，英國Shandon；Motic B5顯微攝像系統，麥克奧迪實業集團公司。臺式冷凍離心機，eppendorf；熒光定量PCR儀、熒光PCR 板，Thermo；恒溫水浴箱，J-MAX；旋渦混合器，其林貝爾；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽，北京六一；-80℃冰箱，中科美菱；電動玻璃勻漿器，新芝；電子天平，民橋；精密pH計，雷磁。膠體金法幽門螺桿菌檢測試劑盒，艾康生物技術（杭州）有限公司，生產批號201203139；TLR4抗體，武漢博士徳 （BA1717）；二抗試劑盒，北京中衫金橋（SP-9002） 逆轉錄試劑盒，Fermentas；EDTA、Tris、DEPC、E.B.，Sigma；Trizol，Invitrogen；Taq 酶 、DL2000 DNA Marker、dNTP，Genstar。 引物， 上海生工；SYBGREEN PCR Master Mix，ABI；IL-6 ELISA 檢 測 試劑 盒 ，R&D公司（E-25764）。普通飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，高糖高脂飼料 （普通飼料+8%蜂蜜+12%豬油）由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司代加工。

1.5 分組與造模 將56只BALB/c小鼠按體質量分層后分為4組，每組14只，雌雄各半。空白組給予普通飼料常規飼養；模型組、滅幽湯組、胃三聯組先給予高糖高脂飼料，自由飲水飼養10 d，于第11日放于溫度（35±2）℃，濕度（95±1）%的人工濕熱箱中，繼續給予高糖高脂飼料，自由飲水。模型組、滅幽湯組、胃三聯組均于第16日灌胃接種1×109cfu/mL濃度的Hp菌液0.3mL/只，灌胃前24 h禁食，4 h禁水；灌胃后禁食禁水2 h。隔日1次，連續接種3次。最后1次接種結束后，飼養條件維持不變，定植2周后以膠體金法檢測血清Hp抗體，取胃黏膜做病理切片觀察炎癥情況，以及做電鏡下觀察Hp定植情況。

1.6 給藥方法 造模成功后，分別給予滅幽湯組、胃三聯組小鼠灌胃給藥，模型組、空白組小鼠給予等量蒸餾水灌胃，每日1次。按照小鼠與人臨床用藥劑量、體型系數公式 dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3計算小鼠用藥劑量，胃三聯組小鼠用藥劑量為279.8mg/kg，滅幽湯組用藥劑量為12.4 g/kg。

1.7 標本采集與檢測 2周后摘眼球取血，然后脫頸椎處死所有小鼠，迅速取出全胃，沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗干凈后放入4%多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，切片。ELISA檢測血清中白介素（IL）-6的含量，免疫組化法檢測小鼠胃黏膜組織中TLR4的蛋白陽性表達，實時熒光定量PCR法檢測小鼠胃黏膜組織中的TLR4基因的mRNA含量。（1）TLR4蛋白陽性表達：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min。0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中微波爐加熱修復抗原。 3%H2O2室溫孵育 10min，PBS 沖洗，5min×3次。10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min。傾去血清，滴加濃度（1∶100）TLR4 的一抗，37 ℃孵育 2 h。 PBS沖洗，5min×3次。 滴加二抗（1%BSA-PBS 稀釋），37℃孵育30min。PBS沖洗，5min×3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育30min。PBS沖洗，5min×3次。加入DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，復染，封片。使用CMIAS真彩色病理圖像分析系統對樣本圖像進行分析。每個樣本隨機選取3個高倍視野，計算黃褐色陽性表達的面密度（陽性表達總面積/統計區域總面積）表示，以此表示TLR4蛋白的表達，進行半定量分析。（2）TLR4基因的含量：提取胃黏膜組織總RNA。逆轉錄cDNA總體系20μL：組織中mRNA為模板進行逆轉錄反應，逆轉錄cDNA；反應條件：70℃加熱 5min，37℃加熱 5min，42℃加熱 1.5 h；72℃反應10min。 TLR4 引物序列為 F：5′-CCTTTCAGGGAATTAAGCTCC-3′，R：5′-ACCGATGGACGTGTAAACCA-3′。qRT-PCR 反應體系總體積 30μL，反應條件：95℃10min，然后95℃ 5 s，54℃ 30 s，共40個循環。 采用相對定量比較actin基因與目標基因的Ct值，得出所測目標基因相對表達量。相對mRNA表達=2-△Ct×100%，△Ct值=靶基因Ct值-actin Ct值。結果由PCR儀配套軟件計算。

1.8 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態性和方差齊性的資料，采用完全隨機化設計的方差分析、多重比較，不符合正態性和方差齊性，用秩和檢驗Kruskal-WallisH檢驗，兩組比較用 Wilcoxon檢驗和 Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠胃黏膜免疫組化結果 見圖1。免疫組化圖片中黃褐色區域為陽性表達。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織TLR4有極少量表達；模型組小鼠胃黏膜組織TLR4有大量陽性表達；滅幽湯組和胃三聯組小鼠胃黏膜組織有少量TLR4陽性表達，明顯少于模型組。

圖1 各組小鼠胃黏膜組織TLR4免疫組化陽性表達

2.2 各組小鼠胃黏膜組織TLR4表達的比較 見表1。空白組小鼠胃黏膜組織中有極少量TLR4表達。與空白組比較，模型組小鼠胃黏膜TLR4表達增加，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），滅幽湯組與胃三聯組小鼠胃黏膜TLR4蛋白表達增加，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），TLR4mRNA 表達增加，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯組小鼠胃黏膜TLR4表達降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；滅幽湯組與胃三聯組相互比較，TLR4表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠胃黏膜組TLR4蛋白及其mRNA表達比較（±s）

表1 各組小鼠胃黏膜組TLR4蛋白及其mRNA表達比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。下同。

組 別 n TLR4蛋白（×10-3μm2） TLR4mRNA（×10-4）空白組 8 5.49±1.10 3.05±0.68模型組 8 78.83±19.66* 65.13±11.45*滅幽湯組 8 14.42±3.92*△ 12.50±6.40*△胃三聯組 8 15.90±5.22*△ 15.23±7.75*△

2.3 各組小鼠血清IL-6表達的比較 見表2。空白組小鼠血清中有極少量IL-6表達。與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-6表達增加，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），滅幽湯組與胃三聯組小鼠血清中IL-6表達增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，滅幽湯組與胃三聯組小鼠血清中IL-6表達降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；滅幽湯組與胃三聯組比較，血清中IL-6表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6比較（±s）

表2 各組小鼠血清IL-6比較（±s）

組 別 n IL-6（ng/L）空白組 8模型組 8滅幽湯組 8 10.60±0.56 38.16±5.26*11.01±1.45△胃三聯組 811.56±1.54△

3 討 論

HAG 屬于中醫學 “胃脘痛”、“痞滿”、“嘈雜”、“泛酸”等病范疇。研究顯示，慢性胃病脾胃濕熱證的Hp感染率較高［12-14］，且Hp為致病生物因子符合現代濕熱證成因的研究［15-16］。 Toll樣受體（TLRs）是先天免疫反應中識別病原微生物并作出防御反應的重要受體，它能特異的識別病原體，介導跨膜信號轉導并誘導活化免疫細胞而觸發一系列的炎癥反應［17］。TLR4是人類發現的第一個TLRs相關蛋白，其主要識別革蘭陰性菌細胞膜上的脂多糖（LPS），而LPS本身并不造成機體的嚴重損害，它主要通過促使巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞等釋放大量的細胞因子，導致機體組織的損害。LPS主要與巨噬細胞表面的Toll4受體結合，最終啟動TNF-α、IL-6等細胞因子基因的表達。

TLR4為巨噬細胞表面LPS的受體［18-20］，其表達的高低與細胞因子的釋放具有直接的關系。幽門螺桿菌LPS可以誘導體內一些炎癥因子如IL-6分泌的增加［21-22］，這可能與幽門螺桿菌 LPS 激活 TLR4/NF-κB傳導通路有關［23-24］。細胞因子在介導和調節免疫應答及炎癥反應過程中起到重要作用，而IL-6是重要的促炎因子之一，具有多種生物學功能，參與細胞免疫、炎癥反應等過程，對炎癥的發展起促進作用，并可致胃十二指腸黏膜的損傷［25］。

滅幽湯功效為清熱利濕、理氣制酸止痛，其中蒲公英、黃連、三七具有抗Hp的作用；陳皮、青皮均具有舒張胃腸道平滑肌作用，可有效緩解胃痛脹滿等癥狀；烏賊骨具有中和胃酸作用，改善胃腸道環境從而影響Hp的生長環境達到輔助抗Hp保護胃黏膜的作用；青皮可改善胃腸血流量，白及具有胃腸道黏膜保護作用，協同三七共同促進損傷的黏膜修復。胃三聯藥物是通過殺滅Hp，在胃黏膜表面形成保護膜干預Hp的定植來治療Hp相關性胃炎，而其他療法不同之處在于使用PPI、H2受體阻滯劑或者中和胃酸制劑，其作用機理為抑制胃酸分泌或者中和胃酸保護胃黏膜，同時胃酸的減少改變了Hp的生長環境，從而達到抑制乃至殺滅Hp的目的。

本研究顯示，模型組TLR4及下游炎癥因子IL-6表達顯著高于空白組，而經藥物治后滅幽湯組、胃三聯組表達顯著降低，說明根除Hp后可以降低TLR4的表達，減少IL-6的產生。根據已知的胃三聯藥物作用機理和藥理研究對中藥組方滅幽湯的認識，推測滅幽湯治療HAG脾胃濕熱證的功效，其機理可能是通過抑制Hp生長，殺滅Hp，干預TLR4、IL-6的表達從而降低胃黏膜組織的炎性程度以達到治療HAG脾胃濕熱證的目的。

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