痰瘀同治對大鼠胸主動脈平滑肌細胞增殖的影響*

薛金貴 王玉琦 郭 煒 高俊杰 蘭德輝 沈智杰 戎靖楓 陳鐵軍 王肖龍 周 華

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203）

動脈粥樣硬化（AS）斑塊的產生和發展是造成血管狹窄的主要因素，而斑塊的不穩定甚至破裂是引起急性冠脈綜合征（包括不穩定型心絞痛和心肌梗死）的罪魁禍首。已有研究提示AS斑塊的形成與炎細胞浸潤、內皮細胞破壞，血管平滑肌細胞（VSMC）增殖、遷移等有關。中醫藥對延緩或逆轉AS斑塊進展的研究尚不多。近年來研究發現，痰瘀互結是許多冠心病患者的主要病機，痰瘀同治可明顯緩解心絞痛。丹蔞片是痰瘀同治的代表方劑，在治療冠心病、穩定AS斑塊等方面有較為顯著的療效，但機制尚不清楚。本實驗通過體外培養血管平滑肌原代細胞，血小板衍生因子BB型（PDGF-BB）誘導其增殖，通過MTT法觀察中成藥丹蔞片藥物血清作用下，VSMC增殖的情況，并闡述其可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 動物 雄性 SD 大鼠，體質量（180±20） g，6～8 周齡，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證號 SCXK（滬）2008-0016。

1．2 儀器與試藥 細胞培養箱（德國Heraeus公司，型號HERAcell150）；倒置生物顯微鏡（重慶光電）；超凈臺（蘇州安泰空氣凈化有限公司，型號BHC-1300IIA/B3）；流式細胞儀（BD FACSCalibur E97501326）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus美國）；離心機（eppendorf美國）。 DMEM（低糖）培養基、PBS、FBS、0．25%胰酶（corning cellgro USA，均購自上海普飛生物技術有限公司）；青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜、細胞固定液、細胞封片液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗小鼠-FITC免疫熒光試劑盒、α-actin SM specific一抗、RNASE、PI、MTT粉末 （均購自上海碧云天生物技術有限公司）。

1．3 含藥血清制備 丹蔞片（吉林康乃爾藥業有限公司）置于研缽中磨粉，精密天平稱取18．8 g溶于200mL無菌注射用水中，磁力攪拌20min，充分溶解，過200目篩網去渣，置于4℃冰箱備用。根據人和大鼠劑量換算，治療組每日藥物灌胃1mL/100 g，對照組不做處理。2周后腹主動脈取血。全血20℃，3000 r/min，離心15min， 取血清，56℃、30min 水浴滅活，0．22μm 針式過濾器濾菌，置-20℃冰箱保存備用。

1．4 原代細胞培養 對照組大鼠取胸主動脈進行原代細胞培養。貼壁法培養原代胸主動脈平滑肌細胞。3 d后可見較多圓形透亮細胞，5～6 d換液，可見組織塊周圍有梭狀細胞爬出，此后換用10%FBS培養液，2～3 d換液1次，繼續培養1周左右，鏡下可見細胞呈“峰-谷”樣排列，待平滑肌細胞鋪滿培養瓶。

1．5 細胞傳代、純化及保存 當培養瓶底部長滿細胞后，可進行細胞傳代。傳代時，將消化吹打形成的細胞懸液靜置15min，使部分成纖維細胞貼壁，輕輕翻轉培養瓶，將培養液轉移至另一個培養瓶中，再次靜置、貼壁，重復上述步驟1～2次，幾次傳代后可獲較純的平滑肌細胞。當細胞傳至第3代時，可進行細胞凍存。裝入凍存管中，置4℃冰箱中2 h，-20℃冰箱中放置1 h，-80℃冰箱中長期保存。

1．6 胸主動脈平滑肌細胞鑒定 細胞以1×106個/mL種于6孔板中，孔內預先置入細胞培養用蓋玻片。待細胞長置80%滿時，去培養液，加入固定液，作用15min，去固定液，加封閉液，置培養箱中封閉1 h。去封閉液，加洗滌液，洗滌 3遍，每次 15min。加入一抗（1∶1000稀釋），培養箱中作用1 h，一抗為actin抗體。回收一抗，洗滌液洗滌3遍，避光加入二抗（1∶400稀釋），培養箱中避光作用1 h，二抗為抗小鼠FITC。回收二抗，加抗熒光猝滅封片液，置熒光顯微鏡下觀察、拍照。鏡下可見鮮綠色與細胞長軸平行的肌絲。

1．7 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測藥物血清對正常VSMCs的影響 分為5組：DMEM組 （空白對照組）、DMEM+N 組 （DMEM+10%正常血清）、DMEM+L組 （DMEM+10%低濃度藥物血清）、DMEM+M組（DMEM+10%中濃度藥物血清）、DMEM+H組（DMEM+10%高濃度藥物血清），每組設6個副孔。將細胞以1×104個/mL種于96孔板中，次日去培養液，加入DMEM培養24 h進行細胞同步，將細胞周期同步于G0/G1期，按照分組加入藥物血清，分別于培養箱中培養24、48、72 h，后去培養液加入5mg/mLMTT 10μL和DMEM 90μL，培養箱中反應3～4 h。吸去MTT液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩 15min，使結晶溶解，置酶標儀，570 nm波長下測吸光度值。

1．8 MTT法檢測藥物血清對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響 實驗方法同正常血管平滑肌。分為5組：DMEM+P 組 （DMEN+PDGF-BB）、DMEM+P+N 組（DMEM+PDGF-BB+10%正 常 血 清 ）、DMEM+P+L 組（DMEM+PDGF-BB+10%低濃度藥物血清）、DMEM+P+M組 （DMEM+PDGF-BB+10%中濃度血清血清）、DMEM+P+H組 （DMEM+PDGF-BB+10%高濃度血清血清），每組設 6 個副孔。分別培養 24、48、72 h。570 nm波長下測試OD值。

1．9 統計學處理 應用SPSS13．0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 原代平滑肌細胞培養及形態學觀察 見圖1。原代培養中，組織塊貼壁后5～7 d，可見少量細胞自組織塊邊緣游出，未成功貼壁的組織塊則無細胞爬出。細胞漸向外生長形成細胞簇，細胞形態多樣（梭形、多角形、星形或不規則形），大小不等。此后細胞呈放射性生長，至培養2周左右局部成束的細胞平行排列，部分區域細胞多層重疊，部分區域高低起伏呈“峰-谷”狀生長。待細胞長滿可進行傳代，90%以上細胞可重新貼壁，生長方式及形態特點同前。

圖1 第3代大鼠VSMC

圖2 VSMCα-actin肌動蛋白免疫熒光染色

2．2 VSMCs組織學鑒定 見圖2。待VSMCs傳至第3代，可進行細胞免疫熒光鑒定。透過熒光顯微鏡，可見VSMCs肌絲呈鮮綠色，與細胞長軸平行排列，表示α肌動蛋白呈陽性表現。

2.3 丹蔞片對正常VSMCs增殖活性的影響 見表1。與DMEM比較，各組VSMCs在不同培養時間都有非常顯著增殖（P＜0.01）。不同濃度藥物血清組與正常血清組相比，無顯著差異（P＞0.05）。不同濃度藥物血清組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表1 丹蔞片對正常平滑肌細胞增殖抑制作用OD值比較（±s）

表1 丹蔞片對正常平滑肌細胞增殖抑制作用OD值比較（±s）

與DMEM組同時間比較，**P＜0.01；與DMEM+L組同時間比較，#P＜0.01。

組別 n 72 h DMEM 組 6 0.656±0.170 DMEM+N 組 6 2.124±0.290**DMEM+L 組 6 1.839±0.136**24 h 48 h 0.647±0.071 0.552±0.077 1.600±0.102**1.756±0.027**1.545±0.067**1.802±0.046**DMEM+M 組 6 2.128±0.155**#1.597±0.044**1.732±0.077**DMEM+H 組 6 1.642±0.071**1.797±0.101**2.272±0.302**#

2.4 丹蔞片對PDGF-BB誘導VSMCs增殖活性的影響 如表2。與DMEM+P相比，各組均有非常顯著差異（P＜0.01）。與正常血清組相比較，24 h低、中濃度血清組與72h各濃度血清組均有差異（P＜0.05）；24 h高濃度血清組與48 h各濃度血清組均有極顯著差異（P＜0.01）。與低濃度血清組比較，48 h高濃度血清組有顯著差異（P＜0.05），24 h高濃度血清組有非常顯著差異（P＜0.01）。

表2 丹蔞片對PDGF-BB刺激下平滑肌細胞增殖抑制OD 值比較（±s）

表2 丹蔞片對PDGF-BB刺激下平滑肌細胞增殖抑制OD 值比較（±s）

與DMEM+P組同時間比較比較，**P＜0.01；與DMEM+P+N組同時間比較，#P＜0.05；與 DMEM+P+N 組同時間比較，△P＜0.01；與 DMEM+P+L 組同時間比較，▲P＜0.01；與 DMEM+P+L 組同時間比較，□P＜0.05。

組 別 n 72 h DMEM+P 組 6 1.670±0.158 DMEM+P+N 組 6 3.723±0.179**DMEM+P+L 組 6 3.539±0.078**#24 h 48 h 1.097±0.183 1.625±0.092 1.865±0.048** 2.855±0.079**1.780±0.056**# 2.695±0.085**△DMEM+P+M組 6 3.487±0.145**#1.747±0.098**# 2.658±0.052**△DMEM+P+H 組 6 1.685±0.037**△▲ 2.594±0.050**△□ 3.481±0.168**#

3 討 論

本實驗選用PDGF-BB作為誘導平滑肌增殖誘導劑。PDGF-BB是一種強烈的細胞絲裂原，可通過激活多條信號通路而調節功能蛋白的磷酸化狀態和相互作用關系，最終抑制或激活靶基因的表達［1-2］。研究發現PDGF-BB通過誘導VSMCs表型轉化致使在不同濃度的PDGF-BB刺激下VSMC活力呈時間、劑量依賴性提高，在PDGF-BB影響下，處于G0/G1期VSMC細胞明顯減少［3］。

AS是多種因素相互作用的復雜過程［4］。典型AS病變多發生在大動脈和中動脈，在包括脂質等多種因素的作用下，VSMC可由收縮型轉變為合成型［5］。合成型的VSMC較收縮型細胞更易于遷移、增殖［6］。在AS晚期，VSMC在炎癥因子作用下，表型發生改變，增殖并向內膜下遷移，吞噬ox-LDL成為泡沫細胞。壞死泡沫細胞及組織碎片形成病變深部糜粥樣柔軟部分，突出于管腔表面，覆以較堅硬的纖維被膜。硬化斑塊的纖維帽結構的發生發展主要是VSMC的遷徙、增殖及基質的沉積，導致動脈管腔的狹窄。不穩定斑塊發生破裂，可造成血栓而導致嚴重不良后果。本實驗將血管平滑肌細胞作為研究對象，通過抑制平滑肌細胞的增殖，從一定程度上改善動脈粥樣硬化的發生和發展。本研究發現，與正常血清組比較，丹蔞片各濃度藥物血清組培養24、48、72 h OD值均有降低，提示丹蔞片藥物血清可抑制PDGF-BB誘導的VSMC增殖。

丹蔞片組方立足于痰瘀同治理論，全方由瓜蔞皮清熱化痰、利氣寬胸，薤白通陽散結，二者相合，化痰散結，行氣導滯，共為君藥。臣以丹參活血涼血、赤芍清熱涼血、川芎活血行氣、葛根益胃生津，共奏活血化瘀、通絡止痛之功。佐以黃芪補氣升陽、澤瀉利水滲濕，以郁金活血行氣、開郁止痛，骨碎補活血補腎為使。全方化痰散結，補氣活血，補而不滯，伐而不過。藥理研究發現，瓜蔞可擴張冠狀動脈增加血流量，提高耐缺氧能力，降低血清膽同醇，抗菌、抗癌等多種作用［7］。丹參中包含丹參酮類、丹參酚酸類，對循環系統也有擴冠、增加血流、減少氧耗的作用［8］。在既往實驗研究和臨床研究的基礎上，證實丹蔞片具有抑制VSMC增殖的作用，為丹蔞片抗AS提供了新的證據。

［1］ 韓雅玲，肖艷平，齊巖梅，等.胚胎血管發育早期PDGF-BB對血管平滑肌細胞趨化的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24（2）：251-256.

［2］ 謝良地，陳海峰，許昌聲.阿魏酸鈉對血管平滑肌細胞熱休克蛋白27磷酸化的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24（12）：2352-2355.

［3］ 高蕊，董麗華，謝肖立，等.PDGF-BB對血管平滑肌細胞表型標志物表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26（12）：2301-2305

［4］ 吳先杰，王永霞.動脈粥樣硬化發生機制研究現狀及思路［J］.中華實用診斷與治療雜志，2012，26（7）：629-631.

［5］ Nataliya A，Pidkovka，Olga A，et al.Oxidized phospholipids induce phenotypic switching of vascular smooth muscle gells in vivo and in vitro ［J］.Circulation Research，2007（101）：792-801.

［6］ Gary K.Owens， Meena S.Kumar， Brian R.Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Developmentand Disease［J］.PhysiolRev，2004（84）：767-801.

［7］ 洪鐵，楊振，劉玉梅，等.丹蔞片對高脂血癥大鼠血管內皮功能的影響［J］.世界中西醫結合雜志，2010，4（6）：308-310.

［8］ 柴瑞震.丹參的藥理研究近況［J］.中國中醫藥科技，2003，10（6）：390.