高壓氧預處理對老齡大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經可塑性的影響*

鄒 磊，劉丹彥，殷 薇，宋 云

(重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科 400016)

研究表明，高壓氧預處理可改善腦缺血再灌注損傷后大鼠的神經功能，但其機制尚不清楚[1-2]。缺血再灌注損傷后神經功能降低與神經再生修復能力降低有關，而軸突生長抑制因子(Nogo) mRNA編碼的Nogo-A蛋白被認為是迄今發現最強的神經再生抑制物，其表達增強，損傷神經的再生修復能力降低[3-4]。因此本實驗擬研究高壓氧預處理對老齡大鼠全腦缺血再灌注損傷時Nogo mRNA、Nogo-A蛋白表達的影響以及從形態學上觀察腦組織損傷情況，以探討其改善神經功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠42只，月齡14個月，體質量480～530 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。分為4組：對照組(C組，n=6)、高壓氧組(H組，n=12)、腦缺血再灌注損傷組(I/R組，n=12)和高壓氧預處理+腦缺血再灌注損傷組(HOP組，n=12)。H組和HOP組大鼠放入單個鼠籠置于YLC 0.5/1A型嬰兒高壓氧艙(武漢船舶設計研究所)，密閉艙門，調整進氣與排氣閥門，維持外界環境大氣壓，氧流量約5 L/min 洗艙5 min，關閉排氣閥，調整進氣閥使艙內壓力在10 min內勻速上升至0.2 MPa，穩壓1 h，關閉進氣閥打開排氣閥，為預防減壓病以0.01 MPa/min速率勻速減壓至0.15 MPa，維持5 min后再勻速減壓至外界環境大氣壓。連續5 d,最后1次高壓氧處理后24 h時I/R組和HOP組采用改良Pulsinelli四血管閉塞法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。

1.2 方法

1.2.1 建立模型方法 參照文獻[5]采用改良Pulsinelli四血管閉塞法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。將大鼠用10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，固定于單臂腦立體定位儀(Stoelting公司，美國)上，開顱，沿大鼠枕骨大孔向下，向兩側分離肌肉和筋膜，充分暴露第一頸椎側翼小孔，顯微鏡直視下采用直徑0.5 mm電凝針灼斷雙側椎動脈，造成永久性閉塞，然后縫合切口，24 h后再次麻醉大鼠，取仰臥位固定于自制手術臺上，頸前切口游離雙側頸總動脈，無創動脈夾夾閉10 min后松開行再灌注。逐層縫合肌肉、皮膚，充分消毒。手術過程中用日光燈(100 W)照射，維持大鼠體溫。大鼠自主呼吸存在，雙側瞳孔散大，對光反射消失，腦電圖顯示呈等電位直線為模型制備成功。

1.2.2 影像學檢查 C組、H組麻醉后，I/R組、HOP組在建立急性全腦缺血模型1 h后進行影像學檢查。大鼠取仰臥位于固定板，3英寸環形表面線圈置于固定板上。先行3平面定位掃描，然后分別行橫斷位及冠狀位T1WI、T2WI掃描。T1WI:SE序列，TR=300 ms，TE=10.0 ms，層厚3 mm，間隔1 mm，FOV 8 cm×8 cm，矩陣256 × 224。T2WI：FRFSE序列，TR=3 600 ms，TE=123.8 ms，層厚3 mm，間隔1 mm，FOV 8 cm ×6 cm，矩陣256 ×224。4組大鼠均按照上述方法行MRI檢查，觀察梗死面積。

1.2.3 Nogo mRNA檢測 H組、I/R組和HOP組于再灌注24 h時隨機取6只大鼠，用10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，快速斷頭開顱取全腦組織，在蒸餾水制成的冰面上分離大腦皮質，用錫鉑紙標記包裹后置于液氮中過夜，然后保存于-70 ℃超低溫冰箱中待用。C組大鼠水迷宮實驗后采集標本。按照試劑盒(北京天根生化科技公司)操作說明提取RNA,Premier 5.0軟件設計并合成目的基因及管家基因的上下游引物。 Nogo-A mRNA上游引物：5′-GCT CTG GAG CTG TCC TTC ACA GTT-3′，下游引物：5′-AGT CTT CTC TGT TAT AAT TTG GG-3′，擴增產物300 bp；以Rat GAPDH為內參，上游引物：5′-TCA CCA CCG TGG AGA ACG C-3′，下游引物：5′-GCT AAG CAG TTG GTA GTT CA-3′，擴增產物229 bp。首先進行常規一步法RT-PCR，將其產物作為母液做10個梯度稀釋，取濃度最低的7個稀釋樣本運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行擴增，得到相對標準曲線。再從變性到延伸整個過程共40個循環，每個樣本均重復3次。反應完畢行融解曲線及凝膠電泳分析以明確目的擴增片段及產物的特異性，最后得到相對標準曲線、融解曲線和樣本的相對定量拷貝數，所得數據由Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀自帶數據分析軟件進行分析。

1.2.4 Nogo-A蛋白檢測 Western blot法采用北京博奧森公司辣根過氧化物酶標記羊抗兔Nogo-A。取凍存腦組織用生理鹽水勻漿后，加入1 mL蛋白裂解液，于4 ℃低溫12 000 r/min離心(離心半徑8 cm)15 min，取上清液，測定蛋白質的濃度并調整為1～2 μg/μL，進行蛋白質的凝膠電泳。整個過程嚴格按照說明書進行，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的相對分子質量和凈光密度值。

2 結 果

2.1 Nogo mRNA與Nogo-A蛋白表達 與C組比較,I/R組和HOP組Nogo mRNA及Nogo-A蛋白表達上調(P<0.05)；與I/R組比較,H組和HOP組Nogo mRNA及Nogo-A蛋白表達下調(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織Nogo mRNA、Nogo-A蛋白表達的比較

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與I/R組比較。

2.2 影像學結果 C組、H組大腦未見明顯缺血梗死灶；I/R組雙側皮質區可見明顯弧形缺血梗死區，T1WI呈低信號；T2WI呈明顯高信號，HOP組雙側皮質區也可見弧形缺血梗死區，面積較I/R組小，T1WI呈等低信號，T2WI呈略高信號，見圖1。

A:C組；B:H組;C:I/R組；D:HOP組。

圖1 4組大鼠大腦皮質MRI檢查結果

3 討 論

本研究采用改良Pulsinelli四血管閉塞法建立全腦缺血模型[5],成功地模擬了臨床上休克、心功能不全、腦血管嚴重狹窄或阻塞合并血液低灌流引起的腦血流循環障礙，以及由此造成的不同程度腦組織急性缺血缺氧損傷。本實驗選擇阻斷雙側頸動脈的時間為10 min，能造成中等程度腦缺血損害而又不至于使所建立模型死亡率升高。參照文獻[6]及預實驗結果，本實驗選擇連續5 d高壓氧預處理(每天置于高壓氧艙內1 h，氧壓為0.2 MPa)的方法進行研究。

通過本研究MRI檢查發現，給予連續高壓氧預適應能減少建模后老齡大鼠大腦皮質超急性期缺血梗死面積，從形態學上證明高壓氧預適應有腦保護作用。腦缺血預適應是指對腦組織采用各種措施，如一次或多次短暫性缺血再灌注后，誘導組織產生內源性保護機制，即機體對短暫缺血的適應性反應，能增加組織細胞對再次缺血的耐受性[7]。研究表明，預處理能激發腦組織產生自身內源性保護物質如神經營養因子和腺苷受體激動劑[8]，增加神經源中熱休克蛋白的表達等多種途徑[9]，從而產生腦保護作用。

研究表明，腦缺血再灌注損傷后神經可塑性的下降是影響神經功能恢復的主要因素[10]，而腦組織Nogo mRNA表達上調，使其編碼的蛋白表達增加可導致神經再生修復能力降[4]。正常情況下Nogo mRNA及Nogo-A蛋白主要在腦皮質、海馬等部位中等強度表達，在急性損傷(如缺血缺氧、腦挫傷等)后表達上調[11]。而大腦皮質對缺血最為敏感，因此，有研究推測腦缺血損傷后腦皮質Nogo-A表達上調，導致神經可塑性降低，再生修復能力降低[12-14]。本研究發現，I/R組Nogo mRNA 及Nogo-A蛋白表達上調，同時大腦缺血梗死面積增大。

有報道表明，缺血再灌注損傷后進行高壓氧處理可下調Nogo-A表達，促進損傷神經再生修復[15]。本研究結果顯示，與C組比較，I/R組和HOP組腦皮質Nogo mRNA 及Nogo-A蛋白表達上調，提示高壓氧預處理同樣可能通過抑制腦皮質Nogo mRNA及Nogo-A蛋白表達上調，改善腦缺血再灌注損傷后老齡大鼠大腦的修復能力。本研究結果還提示，C組和H組腦皮質Nogo mRNA和Nogo-A蛋白表達差異無統計學意義，提示單純高壓氧雖然是一種非生理狀態的刺激，但對老齡大鼠腦的正常功能無影響。

綜上所述，高壓氧預處理通過抑制大腦皮質Nogo-A蛋白過度表達，提高神經可塑性，增加再生修復能力，從而減輕缺血再灌注損傷時腦梗死程度。

[1]Rosenthal RE，Silbergleit R，Hof PR，et al.Hyperbaric oxygen reduces neuronal death and improves neurological outcome after canine cardiac arrest[J].Stroke，2003，34(5)：1311-1136.

[2]Li J，Liu W,Ding S，et al.Hyperbaric oxygen preconditioning induces tolerance against brain ischemia-reperfusion injury by upregulation of antioxidant enzymes in rats[J].Brain Res，2008(1210)：223-229.

[3]Chen Y，Sun FY.Age-related decrease of striatal neurogenesis is associated with apoptosis of neural precursors and newborn neurons in rat brain after ischemia[J]．Brain Res，2007，29(8):9-19.

[4]Chen MS，Huber AB，van der Haar ME，et al.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature，2000,403(6768)：434-439.

[5]Toda S,Ikeda Y,Teramoto A,et al.Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia：modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature[J].Acta Neurochir，2002，144(12)：1297-1304.

[6]Ostrowski RP，Graupner G，Titova E，et al.The hyperbaric oxygen preconditioning-induced brain protection is mediated by a reduction of early apoptosis after transient global cerebral ischemia[J].Neurobiol Dis，2008，29(1)：1-13.

[7] Kapinya KJ．Ischemic tolerance in the brain[J].Acta Physiol Hung，2005，92(1)：67-92.

[8] Lee TH,Yang JT,Ko YS，et al.Influence of ischemic preconditioning on levels of nerve growth factor,brain-derived neurotrophic factor and their high-affinity receptors in hippocampus following forebrain ischemia[J].Brain Res，2008(1187)：1-11.

[9] Selimoglu O,Ugurlucan M,Basaran M，et al.Efficacy of remote ischaemic preconditioning for spinal cord protection against ischaemic injury:association with heat shock protein expression[J].Folia Neuropathologica，2008，46(3):204-212.

[10]Zhan H，Tada T，Nakazato F，et al.Spatial learning transiently disturbed by intraventricular administration of ouabain[J].Neurol Res，2004，26(1)：35-40.

[11]王玉珠，張均田.認知功能和神經可塑性——調節神經可塑性是人參皂苷Rg1改善認知功能的基本機制[J].醫藥導報，2007，26(7)：702-708.

[12]Wang H，Yao Y，Jiang X，et al.Expression of Nogo-A and NgR in the developing rat brain after hypoxia-ischemia[J].Brain Res，2006，1114(1)：212-220.

[13]Lee JK，Kim JE，Sivula M，et al.Nogo receptor antagonism promotes stroke recovery by enhancing axonal plasticity[J].J Neurosci,2004，24(27)：6209-6217.

[14]尹義臣，陳卓銘，杜志宏.卒中后認知功能康復與神經可塑性[J].中國康復醫學雜志,2005，21(15)：471-474.

[15]Zhou C,Li Y,Nanda A,et al.HBO suppresses Nogo-A,Ng-R,or RhoA expression in the cerebral cortex after global ischemia[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，309(2):368-376.