美洲大蠊提取物對肝纖維化大鼠NF-κB和α-SMA表達的影響*

劉麗輝,李 武,馬得宏,陳一暉,王宏圖,張 祿,徐雪美,冉慧粉

(昆明醫科大學第一附屬醫院感染科，昆明 650032)

在前期研究中，本課題組采用四氯化碳復制小鼠肝纖維化模型，結果表明，美洲大蠊提取物(APA)對小鼠實驗性肝纖維化具有一定的保護作用，能夠明顯改善小鼠受損肝臟的病理形態，降低肝纖維化程度[1]。為了進一步研究APA對肝纖維化的治療作用，本研究改用大鼠作為肝纖維化模型，觀察APA對四氯化碳所致大鼠肝纖維化模型是否同樣有治療作用，并探討其抗纖維化的機制是否與其抑制大鼠肝纖維化組織中核轉錄因子-κB(NF-κB)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達有關。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只，胎齡5～6周，體質量120～150 g，由昆明醫科大學動物科提供。實驗過程中飼養條件相同，而且定期清潔、消毒。動物合格證號：SCXK(滇)2011-0004。40只大鼠分成4組,即正常對照組、模型組、APA組和三七丹參組。造模當日即開始灌胃，每天1次，連續7周，直至動物處死。正常對照組和模型組動物按20 mL/kg體質量蒸餾水灌胃，三七丹參組按20 mL/kg體質量灌胃，用量為1 g/kg； APA組給予2.5%原藥20 mL/g體質量灌胃(0.5 g/kg，相當于臨床60 kg成人每日用量的50倍)。20%四氯化碳橄欖油溶液按5 mL/kg給大鼠頸背部皮下注射,每周2次,連續7周。正常對照組動物僅皮下注射相同劑量的橄欖油溶液。

1.2 試劑 四氯化碳(分析純)由昆明澤浩科技有限公司提供，商品編號：1017499。橄欖油(化學純)，由昆明澤浩科技有限公司提供，商品編號：GC1270。NF-κB、α-SMA免疫組化試劑盒由美國Santa Cruz公司提供。Masson試劑盒由福州邁新生物有限公司提供。APA(肝龍)原藥由昆明賽諾制藥有限公司提供，批號：03122001。三七丹參片由昆明醫科大學第一附屬醫院制劑室提供，批號：20120513，每片0.33 g(含生藥0.26 g)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集與觀察指標 觀察動物的體質量、食欲、精神狀況。第7周末，先用乙醚吸入麻醉，立即剖開腹部，找到腹主動脈，用止血鉗夾閉腹主動脈的近心端，用采血針后接針筒輕輕平行插入腹主動脈近心端，放開止血鉗，抽吸針筒，血液即流入針筒內，將血液迅速轉移到加有抗凝劑的離心管中。立即取肝臟左葉中部、左葉及右上葉前部，進行組織病理及免疫組織化學檢查。采用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白(Alb)。

1.3.2 病理組織學檢查 石蠟包埋肝臟組織、切片，進行HE和Masson染色，光鏡下觀察切片，按高志良標準進行GS分級(G為炎性活動度，S為纖維化程度)。

1.3.3 免疫組織化學法檢查 石蠟包埋肝組織，常規切片，放入55 ℃烤箱中3 h以上，取出切片進行脫蠟，用蒸餾水沖洗切片3～5次，用修復液修復，滴加NF-κB和α-SMA一抗(NF-κB和α-SMA按1∶100的濃度進行稀釋)，放入4 ℃冰箱中過夜，然后滴加二抗，放入溫箱內30 min，再進行染色，樹膠封片。采用彩色病理圖文報告分析系統在光鏡下(×200)計算陽性染色面積，即每個視野棕黃色陽性面積占視野總面積百分比(%)的方法來表示。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 正常對照組處死前狀態良好，體質量均大于模型組。模型組大鼠出現飲食減少、尿黃、皮毛粗糙無光澤、乏力、納差、便溏。模型組和APA組大鼠實驗過程中各死亡1只。

2.2 APA對實驗性肝纖維化大鼠肝功能的影響 與模型組相比，APA和三七丹參均能顯著改善大鼠的肝功能，且APA組療效優于三七丹參組(P<0.01)，但是APA組與三七丹參組的Alb水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 解剖及病理形態學表現 解剖發現模型組大鼠肝臟腫大，質硬，顏色灰暗，表面出現小顆粒狀結節，而其余3組大鼠肝臟顏色較模型組紅潤，邊緣規則。HE和Masson染色結果見圖1。正常對照組大鼠肝小葉結構完整，肝索排列整齊，無肝細胞變性壞死及纖維組織增生(圖1A及圖1E)。模型組大鼠肝細胞大量脂肪變性，彌漫性點狀壞死及可見部分灶狀壞死，匯管區有大量炎性細胞浸潤，膠原纖維大量增生并形成假小葉(見圖1B及圖1F)。APA組和三七丹參組肝細胞變性壞死減輕，彌漫性點狀壞死、膠原纖維增生減少，肝纖維化程度降低(見圖1C、1D、1G、1H)。

表1 APA對實驗性肝纖維化大鼠肝功能的影響

△:P<0.01,與正常對照組比較；▲:P<0.01,與模型組比較；◆:P<0.01,與APA組比較。

2.4 大鼠肝臟GS分級 等級資料采用秩和檢驗和Ridit分析，結果顯示，APA組和三七丹參組與模型組相比，大鼠肝組織炎性活動度分級及肝纖維化分期差異均有統計學意義(P<0.01),而APA組與三七丹參組比較，大鼠肝臟炎性活動度分級及肝纖維化分期差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠炎性活動度分級及肝纖維化分期(n)

△：P<0.01，與正常對照組比較；▲：P<0.01，與模型組比較。

A:正常對照組(×200)；B:模型對照組(×200)；C:APA組(×200)；D:三七丹參組(×200)；E:正常對照組(×100);F:模型對照組(×100)；G:APA組(×100);H:三七丹參組(×100)。

圖1 各組大鼠肝組織HE(×200)及Masson(×100)染色結果

2.5 免疫組織化學檢測結果 NF-κB和α-SMA在正常肝組織的所有細胞中均微量表達。NF-κB主要分布在細胞核內及部分胞質，而α-SMA主要在肝細胞的胞質中表達。鏡下觀察模型組大鼠肝組織中NF-κB和α-SMA蛋白表達廣泛，其陽性染色面積均高于正常對照組、APA組和三七丹參組(P<0.01)，且呈現深棕黃色。而APA組與三七丹參組比較，NF-κB蛋白陽性染色面積表達差異無統計學意義(P>0.05)，α-SMA蛋白陽性染色面積表達差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠肝組織中NF-κB和α-SMA陽性表達 面積的比較

△：P<0.01，與正常對照組比較；▲：P<0.01，與模型組比較。

3 討 論

肝纖維化是多種因素作用的結果，越來越多的國內外學者認為肝纖維化主要是由于多種細胞因子激活肝星狀細胞，導致細胞外基質的沉積和降解減少。本實驗主要觀察了NF-κB和α-SMA兩個因子在肝臟中的表達情況，并探討APA抗大鼠實驗性肝纖維化的作用機制。

NF-κB是眾多細胞因子和炎性介質表達的主要轉錄因子，是多種信號轉導途徑的匯聚點[2]。NF-κB蛋白正常情況下與IκBa結合存在于肝臟多種細胞的細胞質中，當NF-κB受到一些反式信號通路激活時(主要是IκB激酶)，它可以使IκBa蛋白泛素化和降解，導致NF-κB激活并向細胞核移位，從而導致肝星狀細胞(HSC)活化并呈現NF-κB的核轉位活性[3]。活化的HSC內NF-κB活性增強，導致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、細胞間黏附分子(ICAM)-1、轉化生長因子(TGF)-β1等NF-κB下游致炎因子表達增強，放大了肝臟炎性損傷反應[4]。長時間的炎性反應導致肝臟的纖維化。

α-SMA被視為肝纖維化的一個很好的標志物，有研究表明氧化應激在HSC活化過程中起了重要的作用，可以刺激HSC活化并轉化為α-SMA陽性的成纖維細胞[5]。此外，雖然α-SMA也可以由其他類型的細胞來表達，但是α-SMA被稱為HSC活化的一個可靠標志[6]。HSC在正常情況下是靜態的，它的激活使過量的膠原蛋白沉積在肝臟而導致肝纖維化[7]。

本實驗病理形態學和血液生化檢查結果表明，APA能顯著降低肝纖維化分期程度和改善肝功能，對四氯化碳所致的大鼠肝纖維化有一定的防治作用。本研究尚發現NF-κB和α-SMA在模型組中高度表達，而在APA組和三七丹參組中表達相對較少，即纖維化程度越高，NF-κB和α-SMA表達水平相對較高。由此可以推斷APA抗纖維化作用可能與其可以降低肝纖維化組織中NF-κB和α-SMA的表達水平有關。進一步深入研究APA與肝纖維化的關系及其潛在的機制具有深遠意義，將為治療肝纖維化藥物開拓新的道路。

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